Generation of mouse models for SIRT genes conditional knock-outs : Phenogenomics of adipocyte-specific retinoblastoma deficient mice

Chez les mammifères, les protéines SIRT, appelées aussi sirtuines, appartiennent à la famille des histones désacétylases (HDAC) de classe III et ont été nommées ainsi pour leur homologie avec le gène de la levure Saccharomyces cerevisiae Sir2. Il est clairement établi que le gène Sir2 joue un rôle primordial dans l extension de la durée de vie de la levure induite par la restriction calorique et que des copies supplémentaires de ce gène retardent le vieillissement chez la levure. Contrairement aux HDAC de classe I et II, les protéines SIRT nécessitent un cofacteur, le NAD+, pour désacetyler les histones ainsi que d importants facteurs régulateurs de la transcription. Le chef de file des sirtuines, SIRT1, semble impliqué dans des pathologies variées telles le diabète, l obésité, l insuffisance cardiaque, le SIDA et les maladies neurodégénératives. Même si le rôle de SIRT1 n a pas encore été clairement établi in vivo, il apparaît indissociable de la régulation de différents processus biologiques allant de l apoptose à la différentiation adipocytaire et musculaire ainsi que dans le métabolisme glucidique en régulant la néoglucogenèse. La fonction des autres SIRT n est pas encore élucidée.Le sujet de ma thèse de doctorat est d essayer de comprendre les fonctions biologiques des gènes SIRT en les inactivant de façon spatio-temporelle par l utilisation de la stratégie du knock-out conditionnel (inactivation conditionnelle) et le système Cre/Lox. Cette technologie permet d inactiver de façon contrôlée le gène d intérêt dans un organe donné d une souris adulte afin d éviter les problèmes liés aux anomalies que l absence du gène pourrait provoquer au cours du développement de l animal lors d un knock-out classique . Pour parvenir à notre objectif, nous avons réalisé des constructions modifiées des différents gènes SIRT. La particularité de ces constructions consiste à introduire des séquences Lox autour du domaine du gène codant pour la partie catalytique de l enzyme. Les Lox sont des séquences nucléotidiques de 34 paires de bases qui sont excisées par l enzyme Cre-recombinase lors de l inactivation du gène. Les vecteurs contenant les gènes SIRT modifiés ont été électroporés dans des cellules souches embryonnaires (ES) de souris 129/Sv afin de s intégrer au génome par recombinaison homologue. Les clones positifs ont été injectés par la suite dans des blastocystes. Nous avons obtenu ainsi des souris transgéniques pour le gène d intérêt. Ces souris doivent par la suite être croisées avec des souris exprimant une protéine de fusion Cre-ERT sous le contrôle d un promoteur spécifique d un organe donné. La protéine Cre-ERT est une fusion entre la Cre-recombinase et le récepteur aux oestrogènes ayant une affinité élevée pour le ligand tamoxifène. En cas d injection de tamoxifène, il y a activation de la Cre qui induit l inactivation du gène d intérêt à un moment donné de la vie de la souris et permet d étudier ainsi les effets biologiques qui en résultent.A l heure actuelle, les constructions pour les gènes SIRT1-7 ont été réalisées. Nous disposons des souris transgéniques pour le gène SIRT2 floxé et les croisements sont en cours avec des souris transgéniques CMV-Cre-ERT2 (inactivation de SIRT2 dans tous les tissus) et Syn-Cre-ERT2 (inactivation de SIRT2 dans les cellules nerveuses). Les autres constructions ont été électroporées dans les cellules ES et sont en cours d analyse.Partie II: Etude de la fonction du gène Rb dans la différentiation adipocytaire et le métabolisme énergétique.Le gène du rétinoblastome Rb est le premier gène suppresseur de tumeur identifié et a été largement étudié. Son rôle a bien été démontré dans différents processus biologiques tels le contrôle du cycle cellulaire, l apoptose, la prolifération et la différenciation cellulaires. Récemment, des études in vitro ont montré que la protéine pRb avait un rôle important dans la différentiation adipocytaire et qu un déficit en pRb provoque un changement dans le programme de différentiation d adipocytes blancs de souris en adipocytes bruns. Dans notre étude, nous avons utilisé le système Cre-lox pour inactiver spécifiquement le gène Rb dans le tissu adipeux. Soumises à un régime riche en graisses, des souris déficientes en pRb restent maigres par rapport à leurs congénères qui voient leurs poids augmenter de manière significative. L analyse histologique et en microscopie électronique du tissu adipeux blanc (WAT) des souris déficientes en pRb montre une transformation d une partie du WAT en tissu adipeux brun (BAT) avec une augmentation significative du nombre de mitochondries suggérant une activité métabolique élevée. L analyse moléculaire a démontré une augmentation de l expression des gènes impliqués dans la dépense énergétique tels UCP-1, PGC-1a et Dio2. Ceci se traduit physiologiquement par une augmentation de la consommation en O2 et de la production de CO2 démontrant une élévation de la dépense énergétique chez les souris pRb-déficientes. Ces données confirment que l absence de pRb provoque la conversion d une partie du WAT en BAT, un tissu connu pour son rôle actif dans la dépense énergétique. Le gène Rb devient ainsi une cible thérapeutique potentielle dans le but d induire une perte de poids chez les patients obèses.