2007•Zhonghua jianyan yixue zazhiRequires access
Detection of the expression level of Toll-like receptor3 by establishing real-time fluorescence quantitative method
杨再兴, 梁艳, 李畅, 曾贤铭, 朱烨, 仲人前
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Abstract
目的 建立检测人Toll样受体3(TLR3)mRNA表达水平的实时荧光定量逆转录PCR(FQ-RT-PCR)法,及探讨其在外周血单个核细胞(PBMC)中的表达水平.方法 用Beacon Designer2.1软件设计TLR3基因特异性引物和荧光探针,逆转录扩增目的片段,构建重组体pMD18-T-TLR3作为定量标准品.在ABI Prism 7000型荧光定量分析仪上,通过荧光强度达到一定阈值时的循环数来定量起始模板,建立标准曲线;并检测30名正常人及20例原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者,20例慢性乙型肝炎肝硬化患者外周血PBMC TLR3基因的荧光强度,根据标准曲线及循环阈值,由软件自动计算样本中TLR3 mRNA的起始拷贝数.结果 FQ-RT-PCR检测TLR3基因的线性范围为102～108拷贝数/μl RNA(r=-0.9974),内参β-actin的线性范围为103～108拷贝数/μl RNA(r=-0.9984);高浓度样本批内和批间变异系数(CV)分别为6.7%和8.7%,低浓度样本批内及批间CV分别为12.3%和14.0%,30名健康人,20例PBC及20例慢性乙型肝炎肝硬化患者PBMC中均有TLR3 mRNA的表达,分别为3.46×102～4.51×103拷贝/μg RNA、4.92×102～1.42×104拷贝/μgRNA和2.58×102～7.17×103拷贝/μg RNA.结论 成功建立检测TLR3 mRNA的FQ-RT-PCR方法,可作为临床和基础研究TLR3基因表达的工具。