2006•Zhonghua chuangshang guke zazhiRequires access
Gene transfer mediated through adeno-associated virus type 2 induces transgenic expression of bone morphogenetic protein-7 in adipose-derived adult stem cells in vitro
Kang Zuo, Liao Weiming, Sheng Zuoyi, Zhang Zuozuo, Xiangwei Yuan, Lei Lei, Huang Bao-ding
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Abstract
目的 构建人骨形态发生蛋白7(hBMP7)基因重组腺相关病毒载体并观察其在脂肪源性干细胞(ADAS cells)中的表达,为骨组织工程探索新的基因治疗方法和细胞来源.方法 以pcDNA1.1/Amp-hBMP7质粒为模板扩增,将回收的PCR产物片段克隆入pUC18载体,获得重组质粒pUC18-hBMP7.双酶切质粒pUC18-hBMP7、pSNAV,回收的两片段转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,获得重组质粒PSNAV-hBMP7.用重组Ⅰ型单纯疱疹病毒HSV1-rc/△UL2感染BHK-21细胞,裂解细胞收获病毒液.采用氯仿处理-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提三个步骤分离浓缩和纯化,测定病毒滴度.培养大鼠ADAS cells,并检测细胞表面标记物.在体外分别转染rAAV2-hBMP7和rAAV2-GFP,流式细胞仪、Western-blot方法检测转染基因的表达.结果 PCR、酶切鉴定以及测序分析表明,BMP7基因成功克隆入质粒pSNAV-hBMP7载体中,并在BHK21细胞中成功包装出具有感染活性的重组腺相关病毒载体rAAV2-hBMP7.早期对ADAS cells的转染效率可达90%,Western-Blot方法检测到第1周与第8周的转染组细胞均有蛋白水平的表达.结论 成功构建了hBMP7基因重组腺相关病毒载体和培养出大鼠ADAS cells,rAAV2-hBMP7载体在体外可高效转染大鼠ADAS cells。