Evaluation of the Sequencing Pipeline for the Oxford Nanopore MinION Long-read DNA Sequencer

Oxford Nanopore MinION on uusi kolmannen sukupolven sekvensointilaite, jolla on monia erityispirteitä. MinION:n käyttämä nanopore -sekvensointimenetelmä perustuu havaittavissa olevien jännitevirtausten muutosten mittaamiseen DNA- tai RNA-juosteiden kulkeutuessa nanokokoisten huokosten eli porejen kautta membraanin läpi. Menetelmä mahdollistaa juosteiden suoran sekvensoimisen ilman välireaktioita. Uniikista sekvensointitavastaan johtuen MinION -laitteen tyyppiominaisuudet ovat hyvin erilaiset kuin laajemmin käytössä olevilla sekvensointilaitteilla. Myös MinION -laitteen poikkeuksellisen pieni koko auttaa sitä entisestään erottumaan kilpailijoistaan. Nanopore-pohjainen sekvensointiteknologia ja MinION ovat kuitenkin olleet kaupallisesti saatavilla vasta lyhyen aikaa. Siksi menetelmä on vielä suurelta osin standardisoimaton ja sen sovellettavuutta tutkimuskäytössä ei pystytä vielä tarkasti arvioimaan. Tässä pro gradu -työssä kuvataan MinION -sekvensoinnin käyttöönottoa sekä arvioidaan sen suorituskykyä. Työn käytännön tutkimus aloitettiin jo ennen laitteen kaupallista julkaisua markkinoille osana erillistä ennakkotestausohjelmaa nimeltä MinION Access Programme (MAP) ja se jatkui katkeamatta myös MinION:n kaupallisen lanseerauksen jälkeen. Tutkimuksessa sekvensoitiin sekä E.coli-kasvatuksesta että ihmisverestä eristettyjä gDNA-näytteitä. Tuloksena saadut sekvenssit oli pääosin mahdollista linjata referenssigenomeihin. Sekvensointi- ja analyysivaiheiden optimoinnin jälkeen yhdellä sirulla pystyttiin tuottamaan tarpeeksi sekvenssidataa kattamaan E.coli-genomi kokonaisuudessaan keskimääräisellä 180x lukusyvyydellä. Tutkimuksessa arvioitiin MinION:n suorituskykyä tavoitteena arvioida, sopiiko menetelmä ihmisgenomin hankalasti sekvensoitavien alueiden luotettavaan tutkimiseen. Lisäksi testattiin mahdollisuutta täydentää sekvensointimenetelmää erillisellä protokollalla kohdennetun sekvensoinnin toteuttamiseksi. Tutkimuksen tulokset osoittavat, että MinION – menetelmää voidaan käyttää pitkien ja linjattavissa olevien sekvenssien tuottamiseen. Sirujen sekvensointikapasiteetti ja sekvenssien laatu kuitenkin rajoittavat menetelmän käytettävyyttä monimutkaisempien genomien tutkimuksessa. Kohdennusprotokollan ja muiden täydentävien menetelmien liittäminen osaksi sekvensointiprosessia voi auttaa näiden puutteiden ratkaisemisessa, mutta tällaisten laajennusprotokollien käyttöönotto saattaa olla haasteellista.