A global analysis of viral mRNA biogenesis during infection with Adenovirus type 5

During the late phase of infection with adenovirus, cellular protein synthesis is shut off, due to a translational block of host cell mRNAs. It has been documented that cellular mRNAs fail to accumulate in the cytoplasm despite continued nuclear synthesis and processing. In contrast, the viral late mRNAs are selectively exported to the cytoplasm via the cellular export receptor TAP/NXF1. Interestingly, the activity of an E3-ubiquitin ligase complex composed of the viral E1B-55K and E4 Orf6 proteins and cellular factors is required, indicating that ubiquitin-dependent proteasomal degradation of one or more proteins could contribute directly or indirectly to the regulation of mRNA export during the late phase of infection. So far, the identity of such substrates is not known, nor has the mechanism by which viral mRNA species are distinguished from their cellular counterparts for export to the cytoplasm been identified; although several different models have been proposed. In these study, we search for possible degradation candidates for the viral-formed ubiquitin ligase. Also, attempting to identify additional parameters that control the differential export of viral and cellular transcripts, we performed global transcriptome analyses (RNA-Seq) to monitor changes in the cytoplasmic accumulation of RNAs expressed from cellular and viral genes as a function of time after infection of A549 cells. In this study, none of the tested cellular proteins were found to be degraded during infection. Thus, the role of the viral E1B/Orf6/E3 ubiquitin ligase in the selective export of viral late mRNAs remains unanswered. During this evaluation, hnRNP M was found to be conjugated by SUMO-1 and SUMO-2. Higher forms of SUMO-2-modified hnRNP M are formed at late time points of infection, depending on the presence of the viral E1B-55K protein. Our results suggest that phosphorylated E1B-55K enhances production of this higher forms of SUMO-2 conjugated hnRNP M. It was also found that hnRNP M accumulates around the viral RCs at late time points of infection. In our transcriptome analysis, we observed an unexpectedly large fraction of cellular transcripts was refractory to the export block and thus escaped the virus-induced export inhibition. Importantly, export ratios of this cluster were increased by a factor of two or greater during the late phase, when compared to the early phase. Gene functional classification analysis shows that mRNA species of this cluster are linked to RNA metabolism and translation. A time comparison between the total amount of cellular vs. viral mRNAs shows that even though cellular mRNAs are equally abundant as in early times, the viral mRNA population is significantly more abundant than cellular transcripts at late times of infection. In sum, these findings show that the impact of HAdV-5 infection on nucleo-cytoplasmic RNA transport is greater than appreciated previously, and suggest that cellular export blockage is not absolute as we found a subset of host cell mRNA transcripts that are preferentially exported to the cytoplasm in the late phase of infection. Also, the high amounts of viral mRNAs that are detected at late times suggest that previous findings, where mostly viral mRNAs were found in the cytoplasm, could be more likely explained by the extremely successful expression of the viral mRNAs than by the blockage of cellular mRNAs export. Es wird weitgehend angenommen, dass die Synthese zellularer Proteine in der spaten Phase einer adenoviralen Infektion inhibiert wird. Die Ursache dieser Inhibierung ist begrundet durch die ausbleibende Akkumulierung zellularer mRNAs im Zytoplasma, die wahrend der Infektion unverandert im Zellkern kontinuierlich synthetisiert und prozessiert wird. Im Gegensatz dazu werden die spaten viralen mRNAs selektiv uber den zellularen Export-Rezeptor TAP/NXF1 ins Zytoplasma transportiert. Erforderlich dafur ist die Aktivitat eines E3-Ubiquitin Ligase Komplexes, bestehend aus den viralen Proteinen E1B-55K und E4 Orf6 Proteinen und weiteren zellularen Faktoren. Dieser Zusammenhang deutet darauf hin, dass der Ubiquitin-abhangige proteasomale Abbau von einem oder mehreren Proteinen, die direkt oder indirekt an der Regulation des mRNA Exportes wahrend der spaten Phase der Infektion beteiligt ist, erfolgen konnte. In den vergangenen Jahren wurde weder dieser Faktor noch der Mechanismus fur den selektiven Export viraler mRNAs identifiziert. In der vorliegenden Arbeit wurden putative zellulare Zielgene, die durch den E3-Ubiquitin Ligase Komplex abgebaut werden, untersucht. Des Weiteren wurde eine globale Transkriptom-Analyse (RNA-Seq) in A549-Zellen durchgefuhrt, mit Hilfe derer die Veranderungen der zytoplasmatischen Akkumulierung der exprimierten RNAs von zellularen und viralen Genen im zeitlichen Verlauf der Infektion untersucht wurden. Damit sollen weitere bisher unbekannte Faktoren, die den differentiellen Export viraler und zellularer Transkripte induzieren, identifiziert werden. Zunachst konnte keiner der putativen zellularen Proteine als Substrat des E3-Ubiquitin Ligase Komplexes identifiziert werden, womit die Rolle der viralen E1B/Orf6/E3 Ubiquitin Ligase im selektiven Export der viralen spaten mRNAs weiterhin unbekannt bleibt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde jedoch gezeigt, dass das zellulare Protein hnRNP M sowohl SUMO-1 als auch SUMO-2 konjugiert wird, was zum spaten Zeitpunkt einer adenoviralen Infektion in Abhangigkeit des viralen E1B-55K Proteins in zunehmend langeren SUMO-2-Ketten mundet. Zudem wurde gezeigt, dass phosphoryliertes E1B-55K die Ausbildung dieser hoher SUMO-2-konjugierten hnRNP M-Formen fordert. Auserdem akkumuliert hnRNP M zum spaten Zeitpunkt der Infektion im Bereich der viralen Replikationszentren (RCs). Die Transkriptom-Analyse identifizierte eine grose Fraktion zellularer Transkripte im Zytoplasma, die nicht wie zuvor angenommen durch die virale Infektion im Nukleus zuruckgehalten wurde. Zudem ist das Export Verhaltnis dieser Fraktion in der spaten Phase im Vergleich zur fruhen Phase um einen Faktor von zwei oder mehr erhoht. Funktionelle Genklassifikationsanalysen zeigen, dass die Produkte der mRNAs dieser Gruppe am RNA-Metabolismus und an der RNA-Translation beteiligt sind. Ein zeitlicher Vergleich der Gesamtmengen an zellularer und viraler mRNAs zeigt bei gleichbleibender Menge an zellularer mRNA Transkripten einen signifikanten Anstieg der viralen mRNA-Transkripte in der spaten Phase der Infektion. Die grose Menge viraler mRNAs zum spaten Zeitpunkt der Infektion im Zytoplasma im Vergleich zur gleichbleibender Menge zellularer mRNAs konnte zu Fehlinterpretationen bisheriger Forschungsergebnisse gefuhrt haben, bei denen ein Ausschalten des Transports zellularer mRNA bei viraler Infektion postuliert wurde. Zusammengefasst zeigt diese Arbeit, dass der RNA-Transport wahrend einer HAdV-5 Infektion einem umfassenderen Mechanismus als zunachst angenommen unterliegt. Durch Transkriptomanalysen konnte gezeigt werden, dass es zu keiner absoluten Blockierung des zellularen mRNA-Exportes kommt, da eine Gruppe an Wirtszell-mRNA-Transkripten gefunden wurde, die bevorzugt in der spaten Phase der Infektion ins Zytoplasma exportiert wird.