Biogenesis of the parasitophorous vacuole membrane (PVM) and regulation of its major component, the early transcribed membrane proteins (ETRAMPs) of Plasmodium falciparum (Welch, 1897) blood stages

Malaria still represents a serious threat to humankind. An effective vaccine is still not available and resistances to all common anti-malarial drugs are widespread. The causative agent of malaria - parasites of the genus Plasmodium - are transmitted during a blood meal of an infected, female Anopheles mosquito. The severest form of malaria in humans, falciparum malaria, is caused by the blood stages of P. falciparum. Due to its obligate intracellular lifestyle, only the invasive parasite stage can be found outside of the host cell. Inside their host cells, hepatocyte during the symptomless liver stage and erythrocyte during the blood stage, the parasites reside in a highly specialized compartment, the parasitophorous vacuole (PV) which is surrounded by a membrane (PVM). The PV forms during the invasion process out of host cell membrane, which is immediately altered and supplemented with parasite derived proteins and lipids. In order to modify its host cell, proteins are exported into the host cell cytoplasm. Those parasites proteins have to pass the parasites plasma membrane as well as the PVM. The same applies also for nutrients taken up by the parasites. Many aspects of this parasite specific compartment have been analyzed before, however its biogenesis had not been examined yet. In this thesis the PV biogenesis was analyzed through the entire development of P. falciparum blood stages by using the recently established 4d-microscopy technique. Utilizing artificial reporters, which were secreted to the lumen of the PV and expressed under the control of stage-specific promoters, this compartment could be observed over the entire 48 hours blood stage development. Furthermore, protein-specific localizations of PV-resident proteins, fused to fluorescent proteins, were examined. An artificial reporter under the control of the 5´ untranslated region (5´UTR) of the early transcribed membrane protein2 (etramp2) gene was used to visualize the PV of early ring stage parasites immediately after the invasion for the first time. These experiments revealed that PV proteins localize to the far end of arm-like extensions during the amebic phase of ring stage parasites while the marker was barely detectable in the remaining PV. This localization was previously described to be specific for compounds of the P. falciparum translocon for exported proteins (PTEX). However, the observation shown in this work suggest that this is a general localization of several PV proteins during that stage. The reporter cell line, under the control of the etramp2 promoter region, was further used to examine the putative translational repression of etramp2 mRNAs during the schizont stage. This reporter, as well as IFAs against ETRAMP2, showed no complete translational repression and an onset of translation in the very late schizont stage, shortly before its rupture. During the early trophozoite development the PV appeared smoothly, except for some protrusions, extending from the parasite. These protrusions observed, were mainly identified as the recently identified cavity, an extension of unknown function, bound to the parasites cytosol. During the PV biogenesis of later stages of trophozoite development two newly identified phases were observed: the strawberry-phase and the gap-phase. The strawberry-phase always occurred concomitantly with the centralization of the parasites food vacuole (FV), an event characteristic for the transition of the trophozoite to the schizont stage. This new phase is characterized, by a rough appearance of the PV and a discontinuous distribution of the reporter-protein within the PV. The strawberry-phase was immediately followed by the gap-phase and was characterized by gaps in the reporter-protein distribution. The GFP seemed to be excluded from those distinct areas of the PV. The end of the gap-phase was characterized by the segmentation of newly formed daughter merozoites. These distinct and reproducible phases of the PV morphology were observed for all reporter cell lines, suggesting general, structural changes. The strawberry-phase may represent the onset of schizogony and the gap-phase its end and the transition to the stage of daughter parasites segmentation. Therefore, they probably represent sub-stages of schizont development, which have to be characterized in more detail on the molecular level in the future. Malaria stellt nach wie vor eine massive Bedrohung fur die Menschheit da. Trotz zahlreicher Versuche gibt es immer noch keinen kommerziell erhaltlichen Impfstoff und Resistenzen gegen alle bekannten Malaria-Medikamente breiten sich immer weiter aus. Die Malariaerreger, Parasiten der Gattung Plasmodium, werden von weiblichen Anopheles-Mucke, wahrend einer Blutmahlzeit, ubertragen. Malaria Tropica, die schwerste Form der Malaria im Menschen, wird von Blutstadien der Spezies P. falciparum ausgelost. In dieser Phase und auch in der symptomlosen Leberphase sind, bedingt durch die obligat, intrazellulare Lebensweise des Parasiten, nur dessen invasiven Stadien auserhalb der Wirtszellen zu finden. Innerhalb ihrer Wirtszellen, Hepatozyten bzw. Erythrozyten, entwickeln sich die Plasmodien stets in einem spezialisierten Kompartimentes, der Parasitophoren Vakuole (PV), die von einer Membran (PVM) umgeben ist. Diese entsteht wahrend des Invasionsprozesses aus der Wirtszellmembran, die jedoch sofort durch parasiteneigene Proteine und Lipide modifiziert wird. Bei der uberlebensnotwendigen Modifikationen der Wirtzelle durch den Parasiten und bei der Aufnahme von Nahrstoffen, mussen sowohl die Parasiten Plasma Membran, als auch die PVM passiert werden. Dieses Kompartiment wurde vielseitig untersucht, aber nie wurde die Biogenese der PV analysiert. Mit Hilfe der seit kurzem verfugbaren vier-dimensionalen-Mikroskopie fur Blutstadien-Entwicklung von P. falciparum konnte in dieser Arbeit die Biogenese dieses Kompartiments genau untersucht werden. Durch die Sekretion von artifiziellen Reportern (Fusionen von einem Signal Peptid (SP) mit Fluoreszenzproteinen unter Kontrolle von stadienspezifischen Promotoren) in das PV-Lumen, konnte die Entwicklung der PV uber die kompletten 48 Stunden der Blutphase beobachtet werden. Auserdem wurden die proteinspezifischen Lokalisationen endogener PV Proteine durch die Fusion mit Fluoreszenzproteinen analysiert. Durch die Expression eines artifiziellen Reporters unter der Kontrolle der 5´untranslationierten Region (5´UTR) des Genes fur das early transcribed membrane protein2 (etramp2) konnte erstmals auch die PV fruher Ringstadien, direkt nach der Invasion, visualisiert werden. Dabei konnten fur die amoboiden Formen der Ringstadien distinkte Proteinlokalisationen, in den Enden der amoboiden Verlangerungen, und kaum im Rest der PV beobachtet werden. Diese zuvor als spezifisch fur Komponenten des Plasmodium Translokons fur exportierte Proteine (PTEX) beschriebene Lokalisation, scheint demnach eine generelle Lokalisation vieler PV Proteine in diesem Stadium darzustellen. Die Reporterzellline, unter der Kontrolle der etramp2 5´ UTR wurde auserdem zur Untersuchung einer postulierten translationellen Repression der etramp2 mRNA im Schizontenstadium genutzt. Es konnte jedoch keine vollstandige Repression beobachtet werde, sondern eine Expression des Reporters bereits im spaten Schizontenstadium, kurz vor dessen Ruptur. Wahrend der fruhen Trophozoitenentwicklung erschien die PV ebenmasig bis auf einige Extensionen, die vom Parasiten ausgingen. Diese Extensionen reprasentierten uberwiegend die kurzlich beschriebene Cavity, eine mit dem Parasitencytosol verbundene Struktur unbekannter Funktion. Es konnte gezeigt werden, dass die PV Biogenese wahrend des spaten Trophozoitenstadiums zwei neu entdeckte Phasen aufweist: die Strawberry-Phase und die Gap-Phase. Die mehrere Stunden andauernde Strawberry-Phase beginnt zeitgleich mit der Zentralisierung der Fressvakuole (FV), welche charakteristisch fur den Ubergang zum Schizontenstadium ist. Diese Phase ist dadurch gekennzeichnet, dass die PV rau erscheint und Reporterproteine in distinkten Bereichen lokalisieren, kontinuierlich unterbrochen von Bereichen ohne GFP-Signal. Die Gap-Phase beginnt im Anschluss an die Strawberry-Phase und ist dadurch gekennzeichnet, dass eine oder mehrere Lucken in der Reporterproteinverteilung auftauchen. Das GFP schien von bestimmten Arealen der PV ausgeschlossen zu sein. Das Ende der Gap-Phase ist durch die sichtbare Segmentierung der neu gebildeten Merozoiten gekennzeichnet. Diese distinkten und reproduzierbaren Phasen der PV Morphologie, beobachtet fur alle Reporterzelllinen, lassen Ruckschlusse auf generelle, strukturelle Veranderungen zu. Die Strawberry-Phase konnte die Einleitung der Schizogony reprasentieren und die Gap-Phase deren Ende und den Ubergang zur Segmentierung der Tochterparasiten. Die beobachten Phasen konnen somit als Sub-Phasen der Schizontenentwicklung bezeichnet werden, die es auf molekularer Ebene weiter zu erforschen gilt.