Role of surfactin from Bacillus subtilis in protection against antimicrobial peptides produced by Bacillus species

Antagonism of antimicrobial action represents an alternative survival strategy for cohabiting soil organisms.Under competitive conditions, our group previously showed that surfactin (Srf) produced by Bacillus subtilis acts antagonistically toward gramicidin S (GS) from a cohabiting bacillus, Aneurinibacillus migulanus, causing the loss the antimicrobial activity of GS.This antagonism appeared to be caused by inactive complex formation.This study aimed to elucidate whether the previously observed antagonism of GS activity by Srf is a general resistance mechanism that also extends to related peptides such as the tyrocidines (Trcs) and linear gramicidins (Grcs) from Bacillus aneurinolyticus.Molecular interaction between the antagonistic peptide pairs was investigated using biophysical analytical methods such as electrospray mass spectrometry (ESMS), circular dichroism (CD), fluorescence spectroscopy (FS) and nuclear magnetic resonance (NMR).Results from this study corroborated the previous findings, namely that Srf antagonised the activity of GS towards Gram positive bacteria.However, for Micrococcus luteus synergism of GS action was observed at low Srf concentrations, while antagonism only occurred at Srf concentrations above the critical micelle concentration (CMC) of Srf when the bacteria were pre-incubated with Srf.This result and an ultra-performance liquid chromatography massspectrometry (UPLC-MS) study indicated that Srf pre-absorbed to cells, as well as Srf micelles interacted with GS, preventing GS from reaching the membrane target.Antagonism of GS action by Srf was also observed towards the Srf producer B. subtilis ATCC21332 and B. subtilis OKB120, a non-producer.The Srf producer was less sensitive than the nonproducer towards GS, possibly due to Srf production.Pre-incubation of Srf at different concentrations caused a dose-dependent antagonism, from as low as 0.9 µM Srf of GS activity towards B. subtilis OKB120.This antagonism at the low Srf concentration may be related to the induction of more resistant biofilms by Srf in B. subtilis.It was also found that Srf significantly improved the survival of B. subtilis OKB120 above that of M luteus in a vii verwant wees aan die induksie van meer weerstandige biofilms deur Srf in B. subtilis.Dit is ook gevind dat Srf die oorlewing van B. subtilis OKB120 aansienlik verhoog teenoor dié van M luteus in ʼn gemengde kultuur.Daar is verder bevind dat die Srf-produseerder, B. subtilis ATCC21332, in die inhibisiesone van die GS-produseerder, A. migulanus ATCC9999, gegroei het tydens kokultivering, terwyl die groei van B. subtilis OKB120 geïnhibeer is.Srf induseer biofilm-vorming in B. subtilis wat moontlik belangrik kan wees om die bakterieë in suspensie te beskerm, maar nie op soliede fase soos byvoorbeeld agar plate nie.Verder dui die beskerming van ʼn verskeidenheid sel-tipes (vorige studies deur ons groep) deur Srf teen GS, ʼn direkte antagonistiese aksie van Srf.Sigbare en stabiele komplekse tussen Srf en GS is waargeneem onder ESMS kondisies, waar die peptiedbindings in die Val-Orn-Leu-D-Phe-Pro eenheid van GS en die Val-Asp-Leu-D-Leu eenheid van Srf beskerm is teen fragmentering in die komplese.1 H-KMR titrasiestudies het duidelik aangetoon dat die molekulêre interaksie van Srf en GS die D-Phe 4,9 en Om 2, 7 residue in GS heroriënteer.SD-spektra van GS-Srf mengsels het daarop gedui dat Srf ʼn konsentrasieafhanklike vermindering in die β-draai komponente van die mengsel veroorsaak, maar dat βplaat komponent van die mengsel vermeerder.Diffusie-georiënteerde KMR spektrometrie (DOSY) toon dat Srf en GS homo-oligomere vorm, maar ʼn hoër diffusie koeffisiënt vir die mengsel het aangedui dat die Srf-GS mengsel kleiner of meer kompakte hetero-oligomere.ROESY-KMR toon dat hierdie oligomere intermolekulêre interaksie(s) van <5Å tussen die Om 2, 7 residue van GS en die Asp residu van Srf het.Die resultate gee ʼn sterk aanduiding dat die onaktiewe kompleks-vorming tussen Srf en GS deelneem in die antagonistiese werking van Srf teenoor GS.Twee hoë verrigting vloeistofchromatografie metodes is ontwikkel om peptiede uit die tirotrisienkompleks, naamlik die Trcs (bevat een GS Val-Om-Leu-D-Phe-Pro eenheid) en die gramisidiene (Grcs), te suiwer.Hierdie peptiede is gebruik om te bepaal of Srf antagonistiese aktiwiteit het wat verder strek as net dié van GS.Dit was inderdaad die geval en daar is viii gevind dat Srf antagonisties is teenoor die antimikrobiese aktiwiteit van Trcs met B. subtilis ATCC21332 en OKB120 as teikens, met tirosidien C (TrcC) wat meer sensitief vir antagonistiese werking van Srf was as tyrosidien B (TrcB).Srf het ʼn gemengde effek getoon teenoor lineêre gramisidien A (GA) wat saam met die Trcs in tirotrisien gekoproduseer word.GA het sinergisties met Srf gewerk by lae GA konsentrasies, maar milde antagonistiese werking getoon by hoë GA konsentrasies.Daarteenoor het GA en TrcB uitgesproke sinergisme getoon teenoor M. luteus.In teenstelling het Srf by 30 µM die sinergistiese aksie van die dodelike mengsel van 25 µM GA en TrcB elk geantagoniseer.Die Srf produseerder was ook bestand en kon in die teenwoordigheid van die tirotrisien produseerder B. aneurinolyticus ATCC10068 groei wat aangedui het dat die antagonisme van antibiotiese peptiedaktiwiteit die kohabitasie van organismes toelaat.Basiese KMR en ESMS studies kon nie kompleksvorming tussen Srf en die Trcs aantoon nie, terwyl SD duidelike bewyse gelewer het dat Srf verandering geïnduseer het in die sekondêre strukture en/of hoër orde/self-geassosieerde strukture van die Trc-Srf mengsel.FS het ook bewyse gelewer van die reoriëntasie/blootstelling van die Trp 6 residu in die Trcs in die teenwoordigheid van Srf.Hierdie resultate ondersteun die vorige bevindinge dat kompleksvorming tussen Srf en GS of GS-peptiedanaloë deel van die meganisme van Srf se antagonistiese aksie uitmaak.Samevattend het hierdie studie getoon dat die antagonisme van GS aktiwiteit deur Srf deels toegeken kan word aan onaktiewe kompleksvorming tussen die twee peptiede en dat die voorgestelde weerstandsmeganisme ook ander peptiede wat die Val-Orn-Leu-D-Phe-Pro eenheid, soos die Trcs van B. aneurinolyticus, insluit.ix Même si le chemin semble étroit et interminable, m'abandonnes jamais tes rêves et ne décline pas tes responsabilités, il y a toujours une récompense au bout de l'effort!Even if the road seems narrow and unending, you shall not let go of your dreams and do not back out your commitments, there is always a price at the finish line!x