Contribution to the study of copper toxicity in Gill of Nile Tilapia, Oreochromis niloticus

O cobre é um micronutriente essencial que se encontra naturalmente em águas não poluídas. Contudo, as actividades mineira, agrícola e industrial, bem como a libertação de efluentes municipais, têm provocado a contaminação crescente dos sistemas aquáticos com níveis tóxicos de cobre. Consequentemente, a necessidade de desenvolver métodos expeditos para avaliar o impacto da toxicidade do cobre na qualidade ambiental e, em particular, na população piscícola, tem vindo a aumentar. Neste contexto, o uso de marcadores biológicos ao nível molecular, celular ou tecidual, tem assumido particular importância, como instrumento sensível de detecção precoce dos efeitos tóxicos, bem como na avaliação da qualidade da água. O epitélio branquial pode constituir um modelo adequado para avaliar a toxicidade do cobre na água. Dada a sua ampla área superficial em contacto directo com o meio externo e o facto de ser o principal local de captação de cobre, a brânquia constitui o primeiro órgão alvo para a toxicidade do cobre. Contudo, para avaliar as alterações morfológicas e fisiológicas causadas pela exposição a este metal, torna‐se necessário em primeiro lugar, caracterizar qualitativa e quantitativamente, a estrutura morfológica da brânquia de Oreochromis niloticus, a espécie usada no presente trabalho. Adicionalmente, alguns parâmetros morfológicos, bioquímicos e moleculares foram avaliados após a exposição dos peixes a diferentes concentrações de cobre ao longo de um período de 21 dias. De acordo com os objectivos propostos, no decurso deste estudo é apresentada a descrição ultrastrutural do epitélio branquial de O. niloticus, bem como a caracterização quantitativa dos seus componentes histológicos. Qualitativamente, o epitélio branquial desta espécie, apesar de similar ao de outros teleósteos de água doce, apresentou algumas características particulares. Entre estas, é de realçar a existência, no epitélio filamentar, de duas regiões morfológica e funcionalmente distintas, uma camada superficial e outra localizada em profundidade. No epitélio filamentar superficial foram observados dois tipos distintos de células ricas em mitocôndrias e as respectivas precursoras, células mucosas e um tipo celular menos comum, as células de suporte. O epitélio profundo é caracterizado pela presença de diferentes tipos de células separados por amplos espaços intercelulares. Nesta região, foi possível identificar células indiferenciadas, neuroendócrinas, macrofágicas e ainda células com características comuns aos eosinófilos. No revestimento baso‐lateral foram observadas células mioepiteliais e um ramo ascendente da membrana basal. Por sua vez, o leito capilar das lamelas apresentou‐se rodeado por pericitos. Os resultados histoquímicos revelaram ainda a existência de subpopulações diferentes de células mucosas e de células neuroendócrinas e permitiram a identificação de células granulares eosinófilas na região profunda do epitélio filamentar. A utilização de anticorpos diferentes permitiu a co‐localização das células ricas em mitocôndrias, sugerindo o seu possível envolvimento em funções neuroendócrinas. Adicionalmente, a presença da H+‐ATPase do tipo V em células pavimentosas sugere a sua contribuição no mecanismo de captação de Na+. Quantitativamente, os dados demonstraram que o epitélio filamentar e a lamela constituem os principais componentes, correspondendo a 28 e 39%, respectivamente, do volume do filamento. Por sua vez, o eixo central (16%) e o seio venoso central (14%) apresentaram densidades volumétricas inferiores. Os volumes ocupados pelas células mucosas e pelas células ricas em mitocôndrias foram de 2 e de 1%, respectivamente. Os efeitos ultrastruturais provocados pela exposição a concentrações subletais de cobre (600 μg L‐1) incluem a retracção das células pilar e a perda de pericitos, na base da lamela. Por outro lado, na região lamelar apical, as células pilar permaneceram inalteradas e os pericitos e as células pavimentosas apresentaram alguns sinais de activação, indiciando uma maior resistência à acção tóxica do cobre. Ao nível do epitélio filamentar, observou‐se uma perda nas células colunares superficiais e, na região profunda, detectou‐se proliferação de células indiferenciadas e conversão de células com características leucocitárias em macrófagos activos. Com o aumento do tempo de exposição, detectaram‐se alguns sinais de regeneração e adaptação ao poluente. A exposição a doses letais (1300 μg L‐1) induziu a retracção das células pilar, o desaparecimento de pericitos e o espessamento da membrana basal. As células colunares desapareceram por completo da região superficial do epitélio filamentar, que ficou restrito a uma monocamada de células pavimentosas. Observou‐se ainda a ruptura focal do epitélio filamentar e do eixo vascular das lamelas. Após 3, 7, 14 e 21 dias de exposição a 40 e 400 μg L‐1 de cobre, foi determinada a acumulação do metal no tecido branquial, que revelou aumentar linearmente com o tempo de exposição e a concentração de tóxico. Por sua vez, a actividade da Na+/K+‐ATPase branquial sofreu uma inibição máxima após 3 dias de exposição, apresentando uma correlação negativa com o cobre acumulado. Os níveis plasmáticos de Cl‐, Na+ e de proteínas, bem como a osmolalidade, diminuíram ao longo do tempo de exposição a 400 μg L‐1. Na concentração inferior (40 μg L‐1), este efeito só foi relevante aos 21 dias de exposição. Os níveis plasmáticos de glucose e cortisol aumentaram de forma dependente do tempo e da dose, demonstrando a activação dos eixos hipotá‐lamo‐pituitária‐células inter‐renais e hipotálamo‐sistema nervoso simpático‐células cromafínicas. As respostas compensatórias ao stress, induzidas pela activação destes eixos, contribuíram provavelmente, para a manutenção das desordens nos parâmetros osmorregulatórios, que se continuaram a observar após tempos prolongados de exposição. Na base dos distúrbios osmorregulatórios podem, adicionalmente, ter estado as alterações histopatológicas induzidas pelas mesmas concentrações de cobre (40 e 400 μg L‐1). Entre estas, são de realçar o edema, destacamento epitelial, alterações na espessura do epitélio filamentar, fusão lamelar, vasodilatação e aneurismas. A extensão e severidade de cada uma foram combinadas no desenvolvimento de uma escala de gradação de severidade. A análise semi‐quantitativa demonstrou que determinadas lesões, como o edema e os aneurismas, variam de acordo com a concentração de cobre, após exposição aguda, enquanto outras, como a fusão lamelar, são melhores indicadores após exposição crónica. Por outro lado, o destacamento epitelial e as alterações na espessura do epitélio reflectem adequadamente o tempo de exposição a concentrações de cobre mais baixas (40 μg L‐1) ou mais elevadas (400 μg L‐1), respectivamente. As variações observadas no perfil gradativo de cada lesão, bem como na escala de severidade cumulativa, apresentaram correlações significativas com o cobre acumulado no tecido branquial, validando portanto, os fundamentos do modelo do ligando biótico. A análise estereológica quantitativa demonstrou que a exposição ao cobre induz diferenças estruturais que se reflectem, principalmente, na densidade volumétrica do epitélio filamentar e da lamela, as quais variaram inversamente ao longo do período de exposição. Os resultados sugerem ainda que os níveis mais elevados de cobre (400 μg L‐1) desencadeiam mecanismos crónicos de defesa, enquanto concentrações mais baixas (40 μg L‐1) conduzem a adaptação, numa resposta aguda moderada. A exposição ao cobre provocou um decréscimo no volume relativo das células mucosas, embora a exposição crónica a níveis elevados, sugira uma resposta compensatória, identificada pelo aumento considerável no volume relativo das células mucosas precursoras. A densidade volumétrica das células ricas em mitocôndrias diminuiu após a exposição ao cobre, principalmente devido a um decréscimo na sua densidade numérica. Contudo, a exposição crónica aos níveis mais baixos de cobre estimulou o aumento das células lamelares. Os resultados quantitativos demonstram ainda que a variação no volume relativo das células está dependente de alterações no epitélio filamentar e na lamela, enfatizando a importância de utilizar metodologias estereológicas na análise e comparação de resultados histológicos. Por último, as concentrações de cobre testadas não induziram, durante o período de tempo analisado, um aumento na expressão do gene da caspase‐3 branquial. Também não foram observadas evidências de activação da enzima já existente ou de indução de apoptose por vias independentes de caspases. Em oposição, a densidade volumétrica das células em proliferação no filamento branquial aumentou significativamente. Contudo, o volume relativo do epitélio filamentar não sofreu acréscimos, sugerindo uma perturbação no equilíbrio entre mitose e degeneração celular.