Impact of cultivation conditions on N-glycosylation of influenza A virus hemagglutinin, on quasispecies composition, and on immunogenicity of virus preparations

Noch heute zählt die Impfung zur wichtigsten Influenzaprävention. Influenzaimpfstoffe werden in embryonierten Hühnereiern oder in tierischer Zellkultur hergestellt.Klare Vorteile der zellkulturbasierten Produktion sind die Unabhängigkeit von Eilieferanten, das Ausschließen möglicher anaphylaktischer Reaktionen auf Eiproteine sowie die Möglichkeit, die Produktion schneller an den aktuellen Bedarf anzupassen.In allen Prozessen stellt das Glykoprotein Hämagglutinin (HA) das Hauptantigen dar.HA ist in der viralen Hülle hoch abundant und löst aufgrund seiner hohen Immunogenität schützende Immunantworten aus.Viele Eigenschaften eines Glykoproteins, wie z.B. Immunogenität, Antigenität, Rezeptorbindungsspezifitäten und Stabilität, können jedoch von dessen Glykosylierung entscheidend beeinflusst werden.Ein grundsätzliches Verständnis der Einflussgrößen verschiedener zellkulturbasierter Kultivierungsbedingungen auf die N-Glykosylierung ist daher essentiell zur Verbesserung des Prozessdesigns z.B. zur Auswahl der Zelle.Der Einfluss der Kultivierungsbedingungen auf das HA N-Glykosylierungsmuster des Influenzavirus A (IVA) wird in dieser Studie mittels kapillarer Gelelektrophorese mit Laser-induzierter Fluoreszenzdetektion-(CGE-LIF-) basierter Glykoanalytik untersucht.In den resultierenden, gut reproduzierbaren Fingerabdrücken repräsentiert jeder Peak mindestens eine bestimmte N-Glykanstruktur.Auf genomischer Ebene erlaubt die Methode der Pyrosequenzierung darüber hinaus die Charakterisierung der viralen Quasispecies.Im Rahmen von in vitro und in vivo Mausstudien wird abschließend in einem transgenen HA-spezifischem T cell Rezeptor (TCR-HA) Modell sowie im BALB/c wildtyp (wt) Modell der Einfluß verschiedener Glykovarianten auf die Immunogenität verschiedener Viruspräperationen adressiert.Diese Studie zeigt, dass vor allem die Wahl des Produktionssystems (MDCK, Vero, AGE1.CR.pIX,Cap, MDCK.SUS1, MDCK.SUS2, MDCK.SUS3 Zellinien und embryonierte Hühnereier) und des Virusstammes (IVA PR/8/34, H1N1; Zusammenfassung II California/07/2009-Reassortant, H1N1pandemic; IVA Uruguay/716/2007-Reassortant, H3N2, IVA Victoria/210/2009-Reassortant, H3N2) das N-Glykosylierungsmuster des HA entscheidend beeinflussen und sowohl das Vorkommen als auch die relativen Häufigkeiten verschiedener N-Glykanstrukturen bestimmen.Bemerkenswert ist, dass eine Adaptation von adhärent wachsenden Madin Darby canine kidney (MDCK) Produktionszellen an serumfreies Zellwachstum nur relative Häufigkeiten HA-assoziierter N-Glykane beeinflusst, während eine Adaptation an Suspensionswachstum in serumfreiem Medium das N-Glykosylierungsmuster grundlegend verändert.Im Allgemeinen ist zur Prozessoptimierung, oft eine Adaptation des Saatviruses an die Produktionszelle notwendig, um optimale Virusausbeuten zu erzielen.Diese Arbeit zeigt, dass der Adaptationsstatus des Viruses lediglich die relative Häufigkeit HA-assoziierter Glykane beeinflusst.Die Steigerung der Ausbeute ist auf erworbene Mutationen während der Adaptation vor allem im HA, aber auch im viralen Nukleoprotein (NP), in der Neuraminidase (NA) und im nichtstrukturellen Protein 1 (NS1) zurückzuführen.Darüber hinaus wird gezeigt, dass der Lieferant/Ursprung des zur Virusproduktion verwendeten Saatviruses, die Viruspassage, die Kultivierungsgefäße und -medien, sowie der Erntezeitpunkt nur einen geringen Einfluss auf relative Häufigkeiten der HA-assoziierten N-Glykane ausüben.Die Relevanz solcher Glykoanalyse für die Qualitätssicherung in der Impfstoffproduktion wird in einem transgenen TCR-HA Mausmodell, sowie in einem BALB/c wt Modell hervorgehoben.Ein Vergleich von MDCK-und Verospezifisch glykosylierten Viruspräperationen des IVA PR/8/34 (H1N1) zeigt einen signifikanten Einfluss der N-Glykosylierung auf die Immunogenität in vitro und in vivo.Außerdem deuten die Daten auf eine ausgeprägtere Unterstützung der humoralen Immunantwort durch die MDCK Zell-spezifische Glykosylierung, sowie auf eine stärkere Förderung der zellulären Immunantwort durch die Vero Zell-spezifische Glykosylierung hin.