Function and regulation of a serine protease implicated in malaria parasite remodelling and egress

Le paludisme demeure une des maladies infectieuses les plus meurtrières au monde. Propagé par la piqûre d un moustique femelle du genre Anopheles, le parasite du paludisme (Plasmodium) migre dans la circulation sanguine et infecte les cellules hépatiques de la victime. Dans le foie, le parasite se différencie et se reproduit par schizogonie à l intérieur d une vacuole parasitophore pour compléter la production de plusieurs milliers de mérozoïtes par cellule hépatique infectée. Ces mérozoïtes sont par la suite libérés dans la circulation sanguine où ils infectent les érythrocytes circulants dans lesquels le parasite subit des cycles d infection, réplication et libération (processus de sortie actif provoqué par le parasite). Ces cycles répétitifs dans le sang sont à l origine des symptômes cliniques de la maladie.Des études sur Plasmodium falciparum ont montré que P. falciparum SUB1 (PfSUB1), une protéase à sérine de la famille des subtilisines, est relâchée à l intérieur de la vacuole parasitophore peu avant la libération des mérozoïtes des hématies. A l intérieur de cette vacuole, la protéase intervient dans la maturation de protéines membres de la famille des SERA (famille de protéines du type papaïne) ainsi qu un certain nombre de protéines de surface du mérozoïte (famille des MSP). Un grand intérêt a été porté sur cette protéase, car l inhibition pharmacologique de l activité de PfSUB1 bloque le processus de sortie et d invasion des mérozoïtes dans le stade érythrocytaire du parasite in vitro.Le stade hépatique du parasite est une cible idéale pour le développement de traitements prophylactiques antipaludiques, car il précède la phase symptomatique de la maladie. En conséquence, il est important de mieux comprendre les mécanismes de fonctionnement du parasite à ce stade. Le présent projet avait pour but principal d effectuer une étude du rôle de SUB1 dans le stade hépatique de Plasmodium. Pour ce faire, ce travail s est effectué sur l orthologue de PfSUB1 chez le parasite murin P. berghei. Dans un premier temps, l expression de PbSUB1 dans les stades hépatiques du parasite a été confirmée en utilisant des anticorps spécifiques et en générant une lignée mutante de P. berghei exprimant la protéine endogène fusionnée à un marqueur hémagglutinine. Par la suite, l enzyme a été exprimée sous forme recombinante et sa fonction et spécificité ont été partiellement caractérisées. Ce travail confirma que la protéase est capable de cliver des peptides basés sur les séquences de PbMSP1 et PbSERA3, substrats potentiels exprimés dans les stades hépatiques du parasite. Finalement, afin de mieux caractériser la fonction de PbSUB1, deux approches récentes permettant d effectuer un knock-out conditionnel chez P. berghei ont été testées: le système Tet et la mutagenèse conditionnelle Flp/FRT. Afin d utiliser cette dernière approche, une nouvelle méthode pour insérer des sites de reconnaissances Flp (sites FRT) dans les régions intergéniques de clones (dans ce cas, un clone comprenant pbsub1 et gènes voisins) provenant d une bibliothèque génomique de P. berghei a été développée. Pour ce faire, plusieurs techniques d ingénierie moléculaire ont été utilisées. Ces techniques, basées sur les systèmes de recombinaison de la levure (recombinase Flp) et de phages (recombineering) similaire à ceux utilisés par le projet PlasmoGEM (Pfander et al., 2012), surmontent les problèmes rencontrés par les méthodes conventionnelles pour le placement des sites FRT et sont aussi applicables aux longues séquences codantes. Avec ces nouveaux outils, un knock-out conditionnel de pbsub1 a été généré avec succès in vivo où la délétion du gène est accompagnée de l expression d un gène rapporteur (GFP) afin de faciliter l identification des parasites ayant perdu le gène d intérêt. A la fin de ce travail, une analyse préliminaire de ces parasites déficients en PbSUB1 suggère un rôle essentiel de cette protéase dans le développement de la phase hépatique du parasite.