Investigating the reverse transmigration of neutrophils in human and murine in vitro models of inflammation

Ο στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη της στρατολόγησης και της αντίστροφης μετανάστευσης ουδετερόφιλων, με χρήση in vitro μοντέλων φλεγμονής από κύτταρα ποντικού και ανθρώπου. Για το σκοπό αυτό αναπτύχθηκαν in vitro μοντέλα φλεγμονής, χρησιμοποιώντας αρχικά μια αθανατοποιημένη κυτταρική σειρά μικροαγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων ποντικού (MCEC-1) και στη συνέχεια πρωτογενή ενδοθηλιακά κύτταρα (mEC) απομονωμένα από την καρδιά και τον πνεύμονα ποντικών. Ανακαλύψαμε ότι τα MCEC-1 μπορούσαν να στρατολογήσουν ποντικίσια ουδετερόφιλα απουσία διέγερσης με κυτταροκίνες, αν και η αποτελεσματική μετανάστευση απαιτούσε ένα τέτοιο ερέθισμα. Τα πρωτογενή κύτταρα mEC απαιτούσαν διέγερση με κυτταροκίνες για να προσελκύσουν ουδετερόφιλα. Σε αντίθεση με τα ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα (EC), τα mEC έδειξαν ελαττωμένη ευαισθησία σε διέγερση με TNF-α, συγκριτικά με την IL-1β, η οποία μπορούσε να επάγει αρκετά αποτελεσματικά την προσκόλληση και τη μετανάστευση των ουδετερόφιλων. Χρησιμοποιώντας IL-1β για την επαγωγή οξείας φλεγμονής στα in vitro μοντέλα, συλλέξαμε ποντικίσια ουδετερόφιλα που είχαν πραγματοποιήσει αντίστροφη μετανάστευση (mRPMN) και αξιολογήθηκε ο φαινότυπος και η παρατεταμένη επιβίωσή τους. Στη συνέχεια, με τη χρήση στρατηγικών μεταφοράς κυττάρων ερευνήσαμε την τύχη των mRPMN in vivo. Παράλληλα, εξετάστηκε η επίδραση της διατμητικής τάσης και του μονοξειδίου του αζώτου στη ρύθμιση της διαδικασίας της αντίστροφης μετανάστευσης των ουδετερόφιλων με τη χρήση ενός in vitro μοντέλου φλεγμονής από ανθρώπινα κύτταρα. Ένα σημαντικό μέρος αυτής της εργασίας περιλάμβανε τη μελέτη των ανθρώπινων ουδετερόφιλων που είχαν πραγματοποιήσει αντίστροφη μετανάστευση (RPMN), σε πρωτεομικό επίπεδο με μεθοδολογία ηλεκτροφόρησης δύο διαστάσεων για τον εντοπισμό αλλαγών στα ουδετερόφιλα που σχετίζονται με τη διαδικασία αντίστροφης μετανάστευσης. Τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι τα ποντικίσια mRPMN είχαν παρόμοιο φαινότυπο με τα ανθρώπινα RPMN όσον αφορά συγκεκριμένους επιφανειακούς δείκτες, ενώ έδειξαν επίσης παρατεταμένη επιβίωση. Ωστόσο, τα προκαταρκτικά μας δεδομένα, όσον αφορά την in vivo κατανομή τους, δεν έδωσαν σαφή ένδειξη σχετικά με την τελική τους τύχη μετά τη μεταφορά τους σε ποντίκια-αποδέκτες. Οι μελέτες στο in vitro μοντέλο φλεγμονής από ανθρώπινα κύτταρα έδειξαν ότι η παρουσία διατμητικής τάσης και το μονοξείδιο του αζώτου καθυστέρησαν, αλλά δεν ανέστειλαν, τη διαδικασία της αντίστροφης μετανάστευσης των ουδετερόφιλων. Τέλος, η πρωτεομική ανάλυση αποκάλυψε τη διαφορική έκφραση ενός αριθμού μεταβολικών, κυτταροσκελετικών και ρυθμιστικών πρωτεϊνών στα ανθρώπινα RPMN, αν και η λειτουργική σημασία αυτών των αλλαγών δεν έχει ακόμη διερευνηθεί.