Μεταβολές των γλυκοζαμινογλυκανών και πρωτεογλυκανών σε ασθενείς με επιθηλιακό καρκίνωμα του λάρυγγα

Ο λάρυγγας αποτελεί μέρος του αναπνευστικού συστήματος και παίζει σημαντικό ρόλο στις λειτουργίες της αναπνοής και της φώνησης. Αποτελείται από δύο είδη ιστών τον επιθηλιακό και τον συνδετικό. Ο τελευταίος παρουσιάζεται κυρίως υπό τη μορφή χόνδρων, οι οποίοι αποτελούν το στηρικτικό σκελετό του λάρυγγα και είναι πλούσιοι σε εξωκυττάρια ουσία. Έχει αναφερθεί ότι σε καρκινικούς ιστούς οι αλλαγές στη δομική σύσταση της εξωκυττάριας ουσίας βοηθούν στην αποσύνδεση και μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων καθώς και στην είσοδό τους στα αιμοφόρα και λεμφικά αγγεία. Σε προηγούμενες μελέτες που πραγματοποιήθηκαν στο εργαστήριό μας αναφέρθηκαν τόσο ποσοτικές όσο και δομικές αλλαγές σε μόρια του ECM σε καρκινικούς ιστούς λάρυγγα, όπως οι PGs aggrecan, versican, decorin αλλά και των ομοιοπολικά συνδεδεμένων σε αυτές GAG αλυσίδων. Λαμβάνοντας υπόψη τα παραπάνω κρίθηκε σκόπιμο όπως η παρούσα διατριβή προχωρήσει σε περαιτέρω και σε βάθος έρευνα των προαναφερθέντων μορίων καθώς και άλλων συσχετιζόμενων με αυτά για να κατανοηθεί περισσότερο ο ρόλος τους στο καρκίνο του λάρυγγα. Έτσι ερευνήθηκαν σε λεπτομέρεια οι GAGs τόσο σε χημικό όσο και δομικό επίπεδο στο χόνδρο και επιθήλιο του λάρυγγα σε διάφορα καρκινικά στάδια. Τα αποτελέσματα έδειξαν σημαντική μείωση όλων των τύπων GAGs στο καρκινικό χόνδρο σε σχέση με τους υγιείς, σε αντίθεση με τους επιθηλιακούς ιστούς που παρουσίασαν σημαντική αύξηση στο καρκίνο. Όσον αφορά στη χημική τους δομή, οι μοριακοί λόγοι των 4S/6S και 0S/totalS δισακχαριτών στον καρκινικό χόνδρο και στο επιθήλιο παρουσίασαν αύξηση. Σε επίπεδο μοριακού μεγέθους, στο καρκινικό λάρυγγα, η χρωματογραφική συμπεριφορά των θειωμένων GAG αλυσίδων και στα δύο είδη ιστών έδειξε μόρια μικρότερου Mr με μεγαλύτερη πολυδιασπορά σε σχέση με τα υγιή. Επιπρόσθετα και στους δύο ιστούς παρατηρήθηκε σημαντική μείωση του HA υψηλού μοριακού μεγέθους. Ακολούθως ερευνήθηκε η έκφραση των PGs aggrecan, versican και decorin σε επίπεδο mRNA σε υγιείς και καρκινικούς ιστούς λάρυγγα ανθρώπου. Παρατηρήθηκε σημαντική και ταυτόχρονα δυσανάλογη αύξηση των versican και decorin στα καρκινικά δείγματα σε σχέση με τα υγιή, ενώ η έκφραση της aggrecan δεν ανιχνεύθηκε στα καρκινικά δείγματα. Τα επίπεδα έκφρασης της decorin στους υγιείς ιστούς ήταν υψηλότερα από αυτά της versican σχεδόν 27 φορές. Σε σχέση με τα υγιή δείγματα τα επίπεδα έκφρασης της decorin στα καρκινικά στάδια II και III παρουσίασαν σταθερή αύξηση (διπλασιασμός) με επιπρόσθετη αύξηση στο στάδιο IV (τριπλασιασμός). Αντίστοιχα τα επίπεδα έκφρασης της versican στα καρκινικά δείγματα παρουσίασαν χαρακτηριστική σταδιοεξαρτόμενη αύξηση, 50-, 90- και 140-φορές στα στάδια II, III και IV, αντίστοιχα. Η υπερέκφραση της versican σε σχέση με την decorin οδήγησε την πρώτη να υπερισχύει στα καρκινικά στάδια III και IV. Οι μεταβολές αυτές παρατηρήθηκαν τόσο στα καρκινικά δείγματα, όσο και στα γειτονικά μακροσκοπικά φισιολογικά δείγματα που λήφθηκαν από τους ίδιους ασθενείς. Στη παρούσα διατριβή μελετήθηκε επίσης η έκφραση των τριών πιο δραστικών αγγρικανασών, ADAMTS-1, ADAMTS-4 και ADAMTS-5 τόσο σε επίπεδο πρωτεΐνης όσο και mRNA. Μετά από RT-PCR ανάλυση παρατηρήθηκε ότι στους υγιείς ιστούς εκφράζονταν και οι τρεις, με τις ADAMTS-1 και ADAMTS-4 να υπερέχουν της ADAMTS-5 στο επίπεδο των 3 και 6.5 φορών αντίστοιχα. Στους καρκινικούς ιστούς η έκφραση των ADAMTS-1 και ADAMTS-4 δεν έδειξε κάποια σημαντική αλλαγή σε σχέση με τα υγιή. Η ADAMTS-5 είχε την πιο σημαντική μεταβολή με σταδιακή αύξηση στα καρκινικά στάδια II και III σε σχέση με τους υγιείς ενώ στο στάδιο IV μειωνόταν σημαντικά. Στα μακροσκοπικά φυσιολογικά δείγματα σε όλα τα καρκινικά στάδια έδειξε ίδια έκφραση η οποία ήταν τετραπλάσια εκείνης των υγιών. Σε επίπεδο πρωτεΐνης, η ADAMTS-1 στους υγιείς ιστούς ανιχνεύθηκε τόσο στο χόνδρο όσο και στο επιθήλιο στη μορφή μίας ζώνης των 34kDa. Δεδομένου ότι το αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε ανιχνεύει το καρβοξυτελικό άκρο του ενζύμου, το μόριο των 34 kDa προφανώς αντιπροσωπεύει το καρβοξυτελικά απομακρυσμένο μέρος της περιοχής του βραχίονα. Τα δείγματα των ασθενών έδειξαν παρόμοια εικόνα μεταξύ τους, αλλά σχετικά διαφορετική από τους υγιείς. Ανιχνευόταν στο PBS εκχύλισμα η ζώνη των 34kDa και στο 4M GdnHCl η ίδια ζώνη, αλλά και δεύτερη στην περιοχή των 87kDa η οποία αντιστοιχεί σε ολόκληρο το ενεργό μόριο και η οποία ήταν πιο έντονη στα πρώτα καρκινικά στάδια..Η ΑDAMTS-4 στους υγιείς ιστούς ανιχνευόταν τόσο στο χόνδρο όσο και στο επιθήλιο με τη μορφή των 68 kDa που αντιστοιχεί στο πλήρως ώριμο ένζυμο. Στα καρκινικά και στα μακροσκοπικά φυσιολογικά δείγματα έδειξε παρόμοια συμπεριφορά με αυτή των υγιών με τη διαφορά ότι στο εκχύλισμα του 1Μ GndHCl από επιθηλιακό ιστό εμφανίζονταν οι μορφές των 100 kDa και 75 kDa που αντιστοιχούν στο ζυμογόνο και στο ολόκληρο ενεργό μόριο αντίστοιχα. Τέλος ανιχνεύθηκαν ζώνες των 50 kDa οι οποίες χρήζουν περαιτέρω διερεύνησης αφού δεν έχουν αναφερθεί ξανά και πιθανό να είναι αποτέλεσμα δράσης άλλων ενζύμων. Η ADAMTS-5 στους υγιείς ιστούς ανιχνεύτηκε και στα δύο είδη ιστών στη μορφή των 73 kDa (ολόκληρο ενεργό ένζυμο), 50 kDa και 40 kDa. Στα καρκινικά δείγματα τόσο στο χόνδρο όσο και στο επιθήλιο ανιχνεύθηκαν οι ίδιες ζώνες όπως αυτές των υγιών, στο μεν χόνδρο στο εκχύλισμα με 4Μ GdnHCl, ενώ στο επιθήλιο σε εκείνο του PBS. Αξιοσημείωτο είναι ότι στους μακροσκοπικά φυσιολογικούς ιστούς ενώ ανιχνεύονται και πάλι οι μορφές των 50 και 40 απουσιάζει η ζώνη των 73 kDa. Συμπερασματικά βλέπουμε πως η αποδιάταξη του ECM φαίνεται να είναι βασικός παράγοντας στην ανάπτυξη του καρκίνου. Παρατηρήθηκαν σημαντικές αλλαγές στην δομή, συγκέντρωση αλλά και έκφραση πολλών κύριων συστατικών του όπως γλυκοζαμινογλυκανών, πρωτεογλυκανών αλλά και των υπεύθυνων για τον καταβολισμό τους ενζύμων.