Colicin Ib 的多聚體化及孔洞形成

大腸桿菌素是一種由大腸桿菌所分泌的細菌素，可以減少環境中其他細菌菌株的競爭。通常大腸桿菌素的抗菌機制被分為三類: 核酸分解、抑制肽聚醣合成和細胞膜去極化。大腸桿菌素Ib (colicin Ib) 是一種孔洞形成型毒素。Colicin Ib由三個功能性結構域所組成， N端易位結構域 (T)、中心受體結合結構域 (R) 以及C端細胞毒性結構域 (C)。細胞毒性結構域由10個α螺旋所組成，其中8個α螺旋為兩親性(C1~7和C10)，2個α螺旋為疏水性(C8,C9)。C8和C9 為完全疏水性的α螺旋，被其他兩親性α螺旋包覆在疏水性核心，外露的親水端則富含帶正電的氨基酸。因此推測colicin Ib可能經由這兩種的α螺旋來達成一個目前尚未了解的殺菌機制。本研究利用生物物理及結構生物學的方式，解析colicin Ib和膜交互作用的特性。實驗結果發現colicin Ib 會和帶負電的微脂體發生交互作用，且為pH-dependent的作用。根據我們所解析的colicin Ib水溶液中的C 結構域的晶體結構，我們認為pH-dependent的現象可能與colicin Ib內鹽橋被破壞有關。此外，根據colicin Ib C 結構域的晶體結構，我們設計了tryptophan 螢光實驗，檢測了內源性tryptophan W133 (位在helices6、7的loop上)、W155 (位在helix 8, 疏水性核心)，以及位在連結helices 8及9 loop上的色胺酸突變位點V165W、L168W。結果顯示W133在pH4的環境下經過帶負電的微脂體誘導，產生紅移的現象，而V165W、L168W則出現藍移的現象。這樣的結果表明colicin Ib C domain 經過巨大的構型改變後，將疏水性helices 8及9插入膜。我們也由化學交聯的方式證明colicin Ib 會由帶負電的微脂體誘導產生多聚體，並且多聚體化和C結構域相關。接著，我們通過螢光恢復術 (FRAP) 的結果，證明了colicin Ib 會經由 C 結構域形成具有篩選性的特定尺寸孔洞。最後，我們製備了colicin Ib 奈米碟，並利用穿透式電子顯微鏡觀察孔洞結構。結果顯示，colicin Ib有被組裝到奈米碟上，但因為背景雜訊過高，無法清楚觀察到孔洞結構。未來將會優化奈米碟樣品，並應用單粒子冷凍電子顯微鏡解析孔洞結構。