Functional exploration of bacteriophage T5 pre-early genes in the host takeover : a route towards new antibacterial strategies ?

Les bacteriophages (phages) sont les virus qui infectent les bacteries. Au debut de l'infection, ils inactivent les defenses bacteriennes et detournent les fonctions cellulaires a leur profit pour produire de nouveaux virions. Les strategies qu’ils utilisent pour prendre le controle de leur hote ont ete etudiees chez tres peu de phages. Une limite a ces etudes est due a la diversite des genes precoces exprimes lors des premieres etapes de l'infection, qui le plus souvent n’ont pas d’homologues detectables ni de fonction connue. Or, ils representent une source importante de nouveaux genes dont les produits sont essentiels pour la neutralisation de l'hote. La decouverte de leur fonction est donc cruciale pour decrypter les mecanismes de prise de controle de l'hote et pour identifier les fonctions bacteriennes ciblees par les proteines des phages.T5 est un phage virulent qui infecte Escherichia coli en utilisant un mode d’injection de son genome en deux etapes. Il transfere d’abord 8 % de son ADN et l’injection s'arrete. Ce fragment, appele locus FST (First Step Transfer), code pour 17 proteines precoces qui inhibent les mecanismes de defense bacterienne, induisent la degradation de l'ADN de l'hote, stoppent la synthese des proteines de l'hote et redemarrent le transfert de l'ADN viral. Le genome complet est alors injecte, permettant la replication de l'ADN et l'assemblage des particules virales, puis la lyse de la bacterie. Seuls trois genes ont ete etudies dans le passe : dmp, gene non essentiel pour l'infection codant pour une phosphatase ; A1 et A2, deux genes necessaires pour la deuxieme etape de transfert de l'ADN. A1 est egalement impliquee dans la degradation de l'ADN de l'hote. Les 14 autres genes precoces sont des genes dits ORFphelins dont les fonctions sont inconnues. Ce mecanisme original d’injection de l'ADN en deux etapes, associe au regroupement des genes precoces dans le locus FST, fait de T5 un modele privilegie pour etudier les premiers evenements de l'infection par les phages.Cette these porte sur l'etude fonctionnelle du locus FST du phage T5. Pour comprendre le role des genes precoces de T5, nous avons d'abord developpe des outils de genetique inverse. Une methode alternative a l'utilisation du systeme CRISPR/Cas a ete mise au point avec T5, permettant de modifier les genomes de phages virulents qui resistent aux nucleases CRISPR/Cas. Ces strategies ont permis d'obtenir des mutants portant des deletions simples ou multiples des genes precoces et d'evaluer leur impact sur l'infection. La deletion de certains genes a entraine des modifications de la production virale, de la latence et de la virulence des mutants testes. La deletion du gene dmp est celle qui altere le plus l'infection, de maniere comparable aux deletions multiples. Un phage T5 avec un locus FST minimal a pu etre construit, suggerant que seuls quelques genes precoces - dont A1 et A2 - sont necessaires pour l’infection. Enfin, pour explorer la fonction des genes precoces de T5, nous avons etudie l'impact de leur expression sur la bacterie E. coli, en dehors du contexte infectieux. Les produits de certains genes sont toxiques et alterent la croissance bacterienne, produisant des perturbations de la morphologie cellulaire ou du nucleoide bacterien, voire induisant une lyse cellulaire. Ces resultats suggerent que certaines proteines precoces interferent avec la division cellulaire, le metabolisme de l'ADN ou l'integrite des membranes. Il est important de noter que la capacite de A1 a declencher la destruction massive du chromosome bacterien a ete observee en l'absence d'infection.Cette exploration des premieres etapes de l'infection par T5 ouvre maintenant la voie vers la caracterisation fonctionnelle et structurale des proteines precoces qui « domestiquent » l'hote au profit de la production virale et pourraient deboucher sur la conception de nouveaux agents antimicrobiens.