Studies on genetic diversity and characterization of cellulolytic enzymes from anaerobic rumen fungi

반추동물은 박테리아, 프로토조아 그리고 곰팡이 등 다양한 미생물의 도움으로, 섭취한 사료를 분해하여 에너지의 형태로 전환시킨다. 이러한 미생물 중 반추위 혐기곰팡이는 단일 균체에 섬유소 분해효소 및 단백질 분해효소를 분비하는 복합효소체계를 가지고 있다. 최근 섬유소 분해 효소는 바이오 에너지 생산과 관련하여 재조명되고 있으며, 생물정보학 및 차세대 염기서열분석 기술의 발전에 따라 새로운 효소의 발견에 가속화를 이루게 되었다. 본 연구에서는 반추위 혐기곰팡이가 생산하는 새로운 섬유소 분해 효소를 찾아내고, 각 효소의 염기서열의 상동성과 그 효소적 특성을 비교 분석하였다. \n\n1.\t반추위 혐기곰팡이 Neocallimastix frontalis PMA02의 탄수화물 대사회로내의 기능성 유전자 분석\n본 연구는 N. frontalis PMA02의 탄수화물 대사회로 내의 기능성 유전자를 expressed sequence tagging 방법을 통하여 알아보고자 실시하였다. 총 10,080개의 clone에 대한 염기서열을 분석한 결과 평균 크기 628bp에 대한 염기서열의 정보를 얻었으며, 중복되는 지점을 연결함으로써 1410개의 contig에 대한 정보와 1360개의 singleton에 대한 정보를 획득하였다. Public data base를 이용하여 염기서열을 분석한 결과 1192개의 clone이 기능이 보고된 염기서열과 일치하였으며, 이중 693개 clone의 염기서열이 곰팡이에서 유래한 단백질과 일치하였다. 기능이 밝혀진 clone 중 154 개의 서열이 생물대사에 관여하는 유전자였고, 328개 clone의 염기서열이 세포구성에 관여하는 유전자였다. 또한 탄수화물의 대사과정에 관여하는 대부분의 효소단백질에 대한 정보를 EST 분석을 통하여 얻을 수 있었다. Hemicellulase인 mannanase, xylose isomerase, xylan esterase 와 xylanase와 β-glucosidases 5종, cellulase 10종이 검출되었다. 본 연구는 N.frontalis 의 탄수화물 분해에 대한 복합 효소 체계를 보고하는 최초의 연구로, 이후 혐기곰팡이의 섬유소 분해 효소 연구에 기초자료로 이용될 것으로 기대된다. \n\n2.\t반추위 혐기곰팡이 Neocallimastic frontalis PMA02에서 분리한 Aacetyl xylan esterase1 의 발현 및 특성에 관한 연구 \n본 연구는 N.frontalis 의 EST 서열 분석에서 분리한 acetyl xylan esterase1(AXE1)의 단백질 발현과 효소 특성을 알아보고자 실시하였다. 발현된 AXE1 단백질은 분자량이 37.3 kDa이며, anaerobic fungus Opinomyces 속 과 Neocallimastric patricicum 에서 분리된 AXEA, bnaI 유전자와 각각 73%, 55.6%의 염기서열 상동성을 갖는다. Aacetyl xylan esterase 1은 pET28b 벡터에 삽입되어 E.coli BL21 (DE3) 에서 발현되었다. Aacetyl xylan esterase 1은 28.1%의 효율로 정제되었으며, 효소역가는 495.2 U mg-1로 정제 전 보다 123.3 배로 증가하였다. Aacetyl xylan esterase 1은 p-nitrophenyl acetate, α-naphthyl acetate, acetylated birchwood xylan과 acetylated beechwood xylan를 분해할 수 있었으며, 반응 적정온도와 pH는 각각 40oC and pH8 이었다. 또한 AXE1과xylanase를 acetylated birchwood xylan에 효소반응 한 경우, xylanase만 단일 반응한 경우에 비해 약 25%의 상보효과를 보였다.\n\n3.\t한국 재래산양에서 분리한 반추위 혐기곰팡이의 형태적, 대사적 그리고 유전자적 특성 비교\n본 연구는 한국 재래산양에 존재하는 반추위 혐기 곰팡이를 분리하고, 각 곰팡이의 형태적, 대사적, 유전자적 특성을 비교하고자 실시하였다. 반추위 누관이 장착된 4마리의 재래산양에서 총 37개의 혐기 곰팡이를 sigmacell, starch, CMC, filterpaper 와 각 4개의 복합 기질을 탄소원으로 이용하여 분리하였다. 분리된 곰팡이는 모두 filamentous 형 가근과 monocentric 형 엽상체가 관찰되었다. 분리된 곰팡이는 형태적 관찰과 ITS1 서열분석을 통해 O25, O27과 O29는 Piromyces 속으로 나머지는 Neocallimastix 속으로 분류되었다. 형태적 분석과 대사유전자의 서열분석을 통한 비교 분석에서는, 각 곰팡이의 특징을 구분지을 명확한 차이를 찾을 수 없었다. 그러나 ITS1 서열 분석에 따라 분리된 곰팡이는 총 9개의 Neocallimastix 속과 1개의 Piromyces속으로 구분할 수 있었다. 특히 Piromyces속으로 분류된 곰팡이의 성장 속도, CMCase와 xylanase의 역가가 Neocallimastix 속보다 상대적으로 낮았다. 이렇게 분류된 곰팡이중 총 7개를 선발하여 이후 연구에 적용하였다. \n\n4.\t한국 재래산양에서 분리한 반추위 혐기곰팡이의 섬유소 분해효소의 유전적 다양성에 관한 연구\n본 연구는 섬유소 분해능력을 근거로 선발된 반추위 혐기곰팡이의 cDNA libray를 구축하고, 효소반응을 기초로 기능성 유전자를 분리, 비교하고자 실시하였다. Neocallimastix 속 6종(G8, G9, G51, G52, G64 and O7) 과 1종의Piromyces속 (O25)의 cDNA library를 구축하였으며, 각 곰팡이 별로 평균 2.1kb 크기의 cDNA가 삽입된 60,000 개의phage를 선발에 이용하였다. 효소 반응에 근거한 선발을 통해 선발된 151개의 clone 에 대한 염기서열을 분석한 결과 Cel45A 그룹이 가장 많이 포함되어 있었으며, 특히cellobiohydrolase는Piromyces속에서만 분석되었다. 혐기곰팡이의 섬유소 분해 유전자 와의상동성 분석에서는 80% 이하가 10개가 있었으며, 선발된 유전자간에는 최고 약 40%의 염기서열 상동성을 갖는 것으로 분석되었다. \n\n5.\t한국 재래산양에서 분리한 반추위 혐기곰팡이의 섬유소 분해효소의 발현 및 특성에 관한 연구 \n본 연구는 섬유소 분해능력을 근거로 선발된 섬유소 분해 효소 유전자의 단백질 발현과 효소 특성을 알아보고자 실시하였다. 각 섬유소 분해 유전자는 pYES2/CT 벡터에 삽입되어Saccharomyces cerevisiae INVSC1에서 발현되었다. 발현된 단백질은 분자량이 43.22kDa 부터 89.37 kDa 으로 다양하였다. 각 섬유소 분해 단백질은 GH 5, GH 6, GH 9 와 GH 45 네 개의 glycosylhydrolase family로 분류되었다. Public data base를 이용하여 아미노산 서열을 분석한 결과 ① O25-7-2, ② O25-13-4, ③ O25-2-2, ④ G8-15, ⑤ G9-9, ⑥ G64-17, ⑦ G7-33와⑧ O7-56는 각각 ① Piromyces 속의 exocellobiohydrolase (81%), ② Piromyces 속의endoglucanase Cel9B(88%), ③ Piromyces 속의endoglucanase 5A(91%),④Piromyces 속의endoglucanase Cel9B(82%), ⑤ Ralstoniasolanacearum의 endoglucanase(46%), ⑥ Orpinomyces속의 glucanohydrolase(69%), ⑦ Piromyces 속의 endoglucanase 45A(82%), ⑧ Rhizopusoryzae의 endo-beta-1,4-D-glucanase(65%)로 분석되었다. 반응 적정 pH는 pH5에서pH 9까지, 적정 온도는 40oC 에서 60oC 까지로 다양하게 분석되었다. 특히 O7-33, O7-56 와 O25-7-2는 80 oC 에서 1시간 처리 후에도 약 40% 정도의 섬유소 분해 능력을 가지고 있어 열 안정성이 우수한 것으로 판단된다. \n\n본 연구의 결과는 반추위 혐기곰팡이의 탄수화물 대사회로에 관련된 기능성 유전자 연구와 섬유소 분해 효소 관련연구의 기초자료로 이용될 수 있을 것으로 기대한다. 또한 본 연구를 통해 획득한 섬유소 분해 효소들은 안전성과 대량배양에 대한 시험이 수행될 경우, 사료 및 바이오 에너지를 비롯한 효소 관련 산업에 적용이 가능할 것으로 판단된다.