Efficient Agrobacterium-mediated Transformation of The Elite–Indica Rice Variety Komboka

Genetic transformation is crucial for both investigating gene functions and for engineering of crops to introduce new traits. Rice (Oryza sativa L.) is an important model in plant research, since it is the staple food for more than half of the world’s population. As a result, numerous transformation methods have been developed for both indica and japonica rice. Since breeders continuously develop new rice varieties, transformation protocols have to be adapted for each new variety. Here we provide an optimized transformation protocol with detailed tips and tricks for a new African variety Komboka using immature embryos. In Komboka, we obtained an apparent transformation rate of up to 48% for GUS/GFP reporter gene constructs using this optimized protocol. This protocol is also applicable for use with other elite indica rice varieties., [摘要 ] 遗传转化对于研究基因功能和农作物工程引入新性状均至关重要。水稻（Oryza sativa L.）是植物研究中的重要模型，因为它是世界一半以上人口的主食。其结果是，大量的转化方法已经开发了两个籼稻和粳稻米。由于育种者不断开发新的水稻品种，因此必须针对每个新品种适应转化方案。在这里，我们为使用未成熟胚的非洲新品种Komboka 提供了一种优化的转化协议，包括详细的技巧和窍门。在Komboka中，我们使用此优化方案对GUS / GFP报告基因构建体的表观转化率高达48％。该协议也适用于其他优质lite 稻品种。[背景 ] 为植物的遗传转化的各种方法公顷一直在开发，例如穿孔（Shimamoto PEG介导的原生质体转染。等人，1989;达塔。等人，1992），生物射弹转化（Christou的等人，1991）和农杆菌-介导的转化（Slamet-Loedin 等，2014）。农杆菌介导的转化是将DNA引入植物的最广泛使用的方法之一（van Wordragen and Dons，1992）。该方法已被广泛用于研究，并已成为生物技术的关键先决条件。自从开发新的育种技术（如基因组编辑）以来，它就变得越来越重要（Char 等，2019）。对于水稻等农作物，遗传转化还可以用于开发新的遗传变异以进行植物育种，例如，创建新的抗病或抗虫品系（Cheng 等，1998； Helliwell和Yang，2013； Oliva 等。等，2019）。同样对于水稻来说，农杆菌介导的转化是将T-DNA转移到植物基因组中最流行的方法（Hiei 和Komari ，2008）。当前，存在使用成熟种子或未成熟胚诱导的愈伤组织进行粳稻和in 稻转化的多种方案（Hiei和Komari，2006和2008； Toki 等，2006； Nishimura 等，2006；Sahoo 等，2011）。；Sahoo和Tuteja，2012；Slamet-Loedin 等，2014；Sundararajan 等，2017）。使用成熟种子进行转化很方便，因为它们一年四季都可以使用并且可以存储，尽管这种方法主要用于粳稻品种。与成熟种子相比，涉及水稻未成熟胚转化的方法通常产生更高的转化率（Hiei和Komari，2008； Slamet-Loedin 等，2014）。总体而言，粳稻品种如Kitaake和日丰nbare显然容易变换，相比籼稻大米如IR64或Ciherang-Sub1的（Oliva的等人，2019） 。对于粳稻品种，使用成熟种子诱导的愈伤组织可以达到50-60％的转化率（Li 等，2015）。对于in 品种，尽管有人为提高成熟种子的转化率做出了一些努力，但未成熟的自苔藓来源的愈伤组织仍然是转化的首选组织。值得注意的是，转化效率高度依赖于品种，因此有必要针对每个品种优化转化方案。 Komboka（IR 05N 221）是IRRI产生的一种新的优良品种，由国家水稻研究计划-卡特琳研究中心和IRRI-坦桑尼亚（'Komboka'='解放'）在坦桑尼亚发行（Kitilu 等人，2019）。Komboka高产（8.6 t ha -1 ），半芳香族，具有良好的谷物品质，耐爆炸，并且非常适合高地和低地地区。在这里报告的协议中，我们描述了Komboka未成熟胚的稳定转化的详细步骤，这些胚可以在四个月内产生转基因植物，并且表观转化率高达48％。这个协议是通过组合和修改从公开的方案开发拉梅希达亚-Loedin 等人。，2014和比睿和Komari ，其用于转化不同，2008 籼稻水稻品种如IR64，Ciherang-SUB1（Oliva的等人，2019），因此，原则上该协议可能可以适于其他转化籼稻水稻品种。在此协议中，我们重点介绍了为其他精英品种建立转化协议必不可少的所有细节，技巧和窍门。 图1. 农杆菌介导的水稻变种未成熟胚转化的流程图和时间表。Komboka（印度）大约需要四个月的时间才能产生转基因品系。简而言之，该过程始于在受控温室条件下，白天将水稻植株生长至开花期，温度为30 °C ±2°C，白天为25 °C ±2 夜间为°C，相对湿度为50-70％。玻璃温室中的光照条件取决于自然日光和其他灯光（8/16天/夜的光照周期）。由于我们的温室沿纬度（德国杜塞尔多夫的纬度和经度，东经51°11'31.2“ N 6°47'40.1” E），白天的时间因季节而异。在这些条件下，Komboka需要1 3 -1 4 周直到启动阶段，另外需要2-3周才能开花。授粉后8-12天，可收获水稻穗以分离未成熟的胚。选择合适的种子阶段以分离未成熟的胚胎至关重要。未成熟胚应在后期阶段乳白色（VID EO 1），尺寸为1.3 - 1.8毫米。将种子去壳并分离未成熟胚（视频2和3；图2）后，将分离出的未成熟胚整体移到共培养培养基上。分离步骤后，将未成熟的胚胎与带有目的构建体的农杆菌共培养7天。然后，用无菌滤纸从农杆菌中清除发芽的未成熟胚，并切下芽。然后将未成熟的胚胎转移到没有潮霉素B的静息/恢复培养基上五天。静息后，将未成熟的胚胎与30 mg / L潮霉素B进行两轮选择，每轮进行10天。在第二选择步骤之后，微愈伤组织出现在褐色的母体未成熟胚上。将微愈伤组织与母体组织小心分离，并转移至选择培养基（30 mg / L潮霉素B）上进行第三轮选择。在该情况下，将未成熟胚没有产生第一两轮选择后microcalli，未成熟胚被转移到一个另外的选择轮（补充选择2）的10天每个。将第三次选择后的抗性和繁殖性微愈伤组织红色转移至再生前培养基（30 mg / L潮霉素B）上，进行1或2轮生长，持续10天。仅将绿化愈伤组织转移至再生培养基（30 mg / L潮霉素B）上14天。当从愈伤组织再生出小的水稻植株（小植株）并达到约5厘米高时，将它们转移到没有潮霉素B的生根培养基上14天。盆中仅种植具有强壮根系的成熟小植株。将盆浸没在较大的水桶（5升）中。 D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 2003199--1495 Wolf Frommer 843004 \ Figs jpg \ Figure01.jpg图1.描述利用水稻品种Komboka的未成熟胚进行农杆菌介导转化的流程图 D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 2003199--1495 Wolf Frommer 843004 \ Figs jpg \ Figure02.jpg图2 。农杆菌介导的水稻品种Komboka 未成熟胚转化的步骤。A.未成熟的胚胎分离。B. 农杆菌感染。C.共培养。D.休息阶段。E.选择阶段。F.再生前阶段。G.再生阶段。H.生根阶段。 下面，我们提供了详细的化学药品，设备清单，重要注意事项的转化步骤以及用于培养基制备的所有模板。