Functional characterization of the tolerance to DNA damage of early embryos

Afin de sauvegarder la stabilite du genome apres exposition aux agents genotoxiques, les cellules possedent un systeme de surveillance, connu comme «checkpoint », qui permet de bloquer le cycle cellulaire en presence de lesions de l’ADN ou suite a un ralentissement de la synthese d’ADN (stress replicatif). De facon surprenante, on sait depuis longtemps que le checkpoint des dommages a l’ADN n'est pas fonctionnel pendant l’embryogenese precoce.Pendant l’embryogenese precoce du xenope, le checkpoint dependent de la kinase ATR est supprime par le recrutement constitutif des ADN polymerases translesionnelles au niveau des fourches de replication, ce qui empeche la formation d’ADN simple brin, un substrat critique pour activer le checkpoint. Ce phenomene est du a la presence de l’ubiquitine ligase Rad18 en quantite elevee dans les embryons precoces et comporte la monoubiquitination constitutive de la proteine de la fourche de replication PCNA. Cette modification postraductionnelle est indispensable pour activer la synthese d’ADN translesionnelle. Puisque la translesion est infidele, en particuliere sur l’ADN non endommage, on peut supposer que les embryons precoces accumulent des mutations.A fin du determiner la contribution de la synthese translesionnelles pendant l’embryogenese precoce, j’ai utilise le xenope et la drosophile comme systemes modeles.D’abord, j’ai observe la presence d’un niveau eleve de PCNA monoubiquitine pendant l’embryogenese precoce de la drosophile, qui diminue en proximite de la transition de midblastula (MBT), ce qui suggere que ce phenomene est aussi conserve chez les invertebres. En plus, j’ai mesure la mutagenese pendant les divisions embryonnaires precoces de la drosophile et du xenope et j’ai observe un taux de mutation plus eleve que les cellules somatiques, neanmoins equivalent a celui connu pour la synthese translesionnelle. Chez les xenope, j’ai aussi observe que la presence de ces mutations depend de l’activite de Rad18. Puisque Rad18 est aussi implique dans la recombinaison homologue, j’ai utilise different mutants de cette proteine et observe une contribution differentielle de Rad18 dans la nature et la frequence des mutations. Ces resultats indiquent que les mutations generees pendant l’embryogenese precoce du xenope dependent de la recombinaison homologue et de la synthese translesionnelle, et sont regule par Rad18. Dans l’ensemble, ces resultats montrent que la synthese translesionnelle est active pendant l’embryogenese precoce des invertebres et des vertebres, et que la replication de l’ADN favorise la mutagenese pendant les premieres divisions embryonnaires. Ceci pourrait constituer un nouveau mecanisme de diversite genetique qui contribue au polymorphisme genetique de l’organisme adulte.Dans la deuxieme partie de ma these, j’ai aussi commence a caracteriser les bases moleculaires responsables du stress replicatif chronique genere pendant la proliferation rapide des cellules souches embryonnaire de souris. Ces cellules proliferent tres rapidement, car les phases G1 et G2 du cycle cellulaire sont presque absents et le checkpoint de la transition G1/S est supprime meme en presence d’endommagements de l’ADN. Puisque ces endommagements sont generes et toleres par ces cellules, les possibles consequences de la presence d’ADN endommage sur l’integrite du genome sont inconnues. J’ai identifie un candidat potentiel responsable de la presence chronique de stress replicatif chez les cellules embryonnaire de souris. Ces donnees peuvent representer la base pour des etudes futures, qui peuvent amener a mieux comprendre les mecanismes moleculaires responsables de la tolerance des lesions de l’ADN chez les cellules pluripotents.