Establishment and application of a real-time PCR method to detect hepatitis B virus cccDNA quantitatively

目的 建立一种HBV cccDNA定量检测方法,并定量检测慢性乙型肝炎患者肝组织内的cccDNA.方法 分析A-G亚型HBV DNA序列,根据其结构特点,于DNA缺口两侧高度保守区域设计引物和探针,并摸索该方法最佳反应条件,以期实现不同亚型HBV cccDNA的特异性扩增.对该方法进行特异性、敏感性及重复性检测.将扩增产物进行测序以检测方法的特异性.用102～1010拷贝/ml的标准质粒检测方法的敏感度.106拷贝/ml标准质粒30复管,以检测其重复性.取32例慢性乙型肝炎患者抗病毒治疗前后的肝穿组织,提取DNA,用该方法进行cccDNA定量,观察抗病毒治疗前后cccDNA的变化及与总HBV DNA的关系.结果 测序结果显示扩增产物为目的片段;该定量方法的敏感度为103～1010拷贝/ml;标准质粒30复管后其Ct值为29.69±0.31,变异系数为1.04%.肝内cccDNA占肝内总HBV DNA的47%～98%,平均81.5%.结论 本方法操作简便,特异性高,定量线形范围宽及重复性好,可用于科研中cccDNA的定量检测。