Sequencing, expression, and site-directed mutagenesis of aurone synthase, a novel polyphenol oxidase from Coreopsis grandiflora, involved in aurone formation

Auronsynthase ist ein neues und seltenes Beispiel fur ein Typ-3 Kupferenzym das die Oxidation des 6'-Deoxychalcons Butein zum 4-Deoxyauron Sulfuretin katalysiert und folglich an der 4-Deoxyauronbildung beteiligt ist. Somit ist die Auronsynthase verantwortlich fur die Bildung von gelben Pigmenten in den Blutenblattern des Madchenauges (Coreopsis grandiflora). Diese Arbeit prasentiert die Isolierung und Sequenzierung von drei neuen Genen, die fur Polyphenoloxidasen kodieren, und in der NCBI Gendatenbank veroffentlicht wurden. Genexpressionsstudien haben gezeigt, dass eines dieser Gene eine bestimmte physiologische Rolle in der Pigmentbildung spielt und wurde daher cgAUS1 genannt. Die anderen beiden Gene sind allelische Varianten bei der Pigmentbildung und wurden daher cgAUS2 a und b genannt. Die jeweiligen zugehorigen Proteine erhielten die Nomenklatur AUS1 beziehungsweise AUS2 a und b. Daher wurde auch das Proenzym AUS1 in E. coli kloniert, exprimiert, aufgereinigt und via massenspektrometrischen Methoden identifiziert. Gelelektrophorese und Aktivitatstests zeigten dass die Auronsynthase (AUS1) nur Diphenolase-Reaktionen katalysiert, wie es auch klassische Catecholoxidasen tun. Weiters zeigte sich, dass AUS1 einem anderen Mechanismus folgt als die fruher beschriebene Aureusidin synthase aus Lowenmaulchen (Antirrhinum majus), das beteiligt ist an der 4-Hydroxyauronbildung deren gelben Blutenblatter. Zielgerichtete Mutationen um die Kupfer A Bildungsstelle (CuA) von AUS1 zeigten, dass das Phenylalanin, das uber dem Kupfer A liegt, und das Cystein, das eine Thioetherbrucke mit einem der kupferkoordinierenden Histidine bildet, verantwortlich sind fur Aktivitat und damit Funktion des Enzyms, aber nicht am Kupfereinbau beteiligt sind. Mutationen der CuA koordinierenden Histidine zeigten, dass jedes einzelne Histidin erforderlich fur den Kupfereinbau ist und damit auch fur Funktion des Enzyms unentbehrlich sind.