Organization of Bacterial Cell Pole

Chez les bacteries, les poles cellulaires servent de domaines subcellulaires impliques dans plusieurs processus cellulaires. Chez l’agent pathogene du cholera, Vibrio cholerae, en forme de bâtonnet incurve, le pole contenant l’unique flagelle est implique dans la virulence. La proteine d’ancrage polaire HubP interagit avec plusieurs ATPases telles que ParA1 (segregation des chromosomes), ParC (localisation polaire du systeme de chimiotaxie) et FlhG (biosynthese des flagelles), organisant ainsi l'identite polaire de V. cholerae. Cependant, les mecanismes moleculaires exacts de cet ancrage polaire doivent encore etre elucides. L’objectif de cette these est d’etablir une vue d'ensemble de l'organisation de pole cellulaire ce qui implique le mecanisme d’orchestration des differentes fonctions cellulaires par l’identification de l’ensemble des partenaires d'interaction de HubP ainsi que la cartographie fine du pole cellulaire par microscopie a super resolution (PALM).Afin d’identifier de nouveaux partenaires d'interaction de HubP, j'ai etudie la difference de composition en proteines polaires entre les contextes HubP+ et HubP-. La composition en proteines polaires a ete quantifiees de maniere relative et absolue en ajoutant des Tag isobares aux proteines extraites de mini-cellules. Ces mini-cellules correspondent des petits compartiments cellulaires issus d’un evenement de division anormal proche du pole et sont enrichies en proteines polaires. Parmi ~800 proteines identifiees, ~ 80 proteines ont ete considerees comme enrichies en contexte HubP+ incluant de nombreuses proteines attendues (FlhG, ParC et en aval des proteines de chimiotaxie). J'ai etudie la localisation de 14 proteines par microscopie a fluorescence et pu reveler 4 nouvelles proteines presentant une localisation polaire dependant de HubP : VC0632 ou DacB, VCA0220 ou HlyB, et 2 proteines hypothetiques VC1909 et VC2232. La deletion de vc1909 et vc2232 provoque un defaut significatif de propagation dans une gelose molle suggerant une implication dans la chimiotaxie et/ou la motilite. Alors que la microscopie electronique a montre que les deux mutants ont bien un flagelle polaire unique, le suivi-video de leur deplacement a revele que les deux mutants presentaient des defauts de nage assez distincts: ∆vc1909 est plutot affecte dans le changement de direction et ∆vc2232 dans la vitesse de deplacement. Des experiences de microscopie fluorescente ont montre que VC1909, VC2232 et HubP presentaient des dynamiques de localisation polaire distinctes au cours du cycle cellulaire.Pour une observation fine du pole cellulaire par PALM, de nouveaux outils d’analyse d’image a haut debit etaient exiges. La precision des contours des petites cellules bacteriennes faiblement contrastees n’est pas suffisante par l’observation en fond clair, j'ai developpe une nouvelle technique de marquage avec des proteines fluorescentes photo-activables pour un trace precis de la membrane interne ou du periplasme. En outre, nous avons cree un logiciel utilisant Matlab appele Vibio qui integre le contour de cellule et la liste des molecules obtenues par microscopie a super resolution. La capacite d’analyse a haut debit du logiciel permet d’etudier la distribution des molecules de l’echelle de la cellule unique a une population en orientant les cellules par leur courbure longitudinale. J’ai pu reveler que HubP est principalement localise du cote convexe du pole de la cellule, tandis que ses partenaires se situaient principalement au milieu du pole.Mon travail de these a revele avec succes de nouveaux partenaires d'interaction de HubP et la fonction de certaines proteines dans la motilite cellulaire. J'ai developpe une nouvelle technique de microscopie pour une localisation sub-polaire precise qui fonctionne bien pour l'analyse d'images PALM dans Vibio. J’ai ainsi pu faire progresser les connaissances de l’orchestration des fonctions polaires chez V. cholerae.