The Staphylococcus epidermidis biofilm matrix : functional components, molecular interactions and targeted enzymatic disruption

Die vorliegende Arbeit beschaftigt sich mit der Bildung von Staphyloccoccus epidermidis Biofilmen. Vorrangig untersucht wurde die raumliche Anordnung der Proteine in Protein basierten Biofilmen. Hier bei konnte festgestellt werden, dass das small basic protein (Sbp) fur die Oberflachenadharenz verantwortlich ist. Des Weiteren wurde das aus 3 Sub-domanen (A & B) bestehende Accumulation association protein (Aap) untersucht. Es wird angenommen, dass jede Domane eine eigene Funktion besitzt, wobei eine 212 Aminosauren grose Region zwischen den Domanen proteolytisch gespalten werden muss, um die volle Strukturierung eines Biofilmes zu erreichen. Es wurden Deletionsmutanten mit je einer der Aap Domanen A und B, sowie der Domane B + die 212 Region komplementiert. Es zeigte sich, dass Domane A fur die Oberflachenadharenz und Domane B fur die typische Pilz-ahnliche Biofilmstruktur, sowie Zell-Zell Adharenz verantwortlich ist. Daruber hinaus konnte festgestellt werden, dass Domane B+212 zu einer Biofilm-Mischform fuhrt, welche die Oberflachen Adharenz von Domane A mit der Zell-Zell Adharenz von Domane B zeigte. Der Biofilm war nicht so strukturiert wie durch den Einfluss von Domane B. Dies unterstutzt die These, dass die 212 Aminosaureregion proteolytisch gespalten werden muss, um die typische Biofilmstruktur zu erhalten. Ein weiteres untersuchtes Protein Embp (extracellular matrix binding protein) zeigte eine heterogene Verteilung innerhalb des Biofilmes, sowie direkte Kolokalisation zu dem Polysaccharide intercellular adhesin (PIA). Es konnte festgestellt werden, dass Embp direkt an den Bakterienzellen haftet und diese durch elongierte Strukturen miteinander verbindet. Daruber hinaus konnte festgestellt werden, dass Embp vermehrt produziert wird, wenn die Bakterienzellen antibiotischem Stress ausgesetzt werden. So bildete der Biofilm negative Stamm S. epidermidis 1585 unter antibiotischem Stress Biofilme auf Embp Basis, welche protektive Eigenschaften gegenuber Phagozytose zeigten. Die Untersuchung putativ Biofilm zerstorender Fosmidklon Extrakte (100 E3, 100 B3 und 64 F4) aus einer Metagenombank zeigten reproduzierbare Degradation eines S. epidermidis 1457 Biofilmes. Weitere Charakterisierungsversuche durch Mikroskopie, Live/Dead Farbung, biochemischer Tests und bioinformatischer Untersuchungen, sowie Massenspektrometrie und Gelfiltration zeigten, dass vor allem Zucker modifizierende Enzyme die auf dem Fosmidklon 100 E3 kodiert sind die vielversprechendsten Kandidaten fur die Disruption des Biofilmes sind. Sogar nach Hitzeinaktivierung zeigte der Extrakt des Fosmidklones 100 E3 noch Biofilm abbauende Wirkung. Daher wurde Fosmidklon 100 E3 genauer untersucht, indem die vielversprechenden Enzyme subkloniert und versuchsweise uberexprimiert wurden. Eine Uberexpression war nicht erfolgreich, weder in Escherichia coli, Pichia pastoris, Pseudomonas antarctica, noch in vitro. This work focuses on Staphylococcus epidermidis biofilm formation. Interactions between relevant protein factors contributing to biofilm formation, as well as their spatial distribution inside a developing and a mature biofilm are important to understand their function. The main factor involved in S. epidermidis biofilm accumulation, polysaccharide intercellular adhesin (PIA), has been investigated in life cell imaging experiments, showing that some starter cells expressed PIA from the initiation of cell aggregation and biofilm formation. The biofilm started to enhance height before spreading over the whole colonization surface. The extracellular matrix binding protein Embp showed to be inducible by antibiotic treatment and led to biofilm formation with the same protective properties against macrophages as PIA-based biofilms. Co-localization of Embp and PIA has been investigated, showing an increase in biofilm strength when both components were expressed simultaneously. Identification of the function of each sub-domain of Accumulation association protein Aap (A, B and B+212) has been achieved by complementing Aap deletion mutants S. epidermidis 1457Δaap, S. epidermidis 1457-M10Δaap and S. epidermidis 1457-M10ΔaapΔsbp with each sub-domain. It could be shown that domain B was mainly responsible for the typical mushroom-like biofilm structure, while domain A led to a multi layered non structured biofilm. The expression of domain B+212 led to a semi-structured biofilm with some aggregates and non-structured cell layers. The analysis of Sbp and the sub-domains of Aap did not show significant co-localization. The investigation of putative biofilm disrupting fosmid clones derived from a metagenomic library brought up 3 fosmid clones (100 E3, 100 B3 and 64 F4) with biofilm degrading properties. All fosmid clones have been analyzed for their biofilm disrupting properties using Live/Dead experiments, biochemical tests, bioinformatic tools, mass spectrometry and gel filtration. Glycosyltransferases encoded on fosmid clone 100 E3 seemed the most promising enzymes, but their over expression has not been successful in neither E. coli, Pichia pastoris, Pseudomonas antarctica, nor in vitro expression. The effect of the fosmid clones on S. epidermidis 1457 biofilms has been investigated using microscopy techniques showing a reproducible destruction of S. epidermidis 1457 biofilms. Fosmid clone 100 E3 even showed disrupting properties after heat treatment at 70 °C.