Microbiological and biochemical investigations of cocoa bean fermentation

Cocoa beans are the principal raw material used in chocolate production. These seeds are derived from the fruit pods of the cocoa tree (Theobroma cacao L.), which is cultivated in plantations in the equatorial zone, with Ivory Coast, Ghana and Indonesia as the major producers. Raw cocoa has an astringent unpleasant taste and a spontaneous fermentation is the first step in a process leading cocoa beans to develop their characteristic cocoa flavour and taste. The quality of raw cocoa beans is highly dependent on the post-harvest practice of fermentation. Three main phases occur during cocoa bean fermentation: phase 1 anaerobic fermentation by yeasts, phase 2 microaerophilic fermentation by lactic acid bacteria and phase 3 aerobic fermentation by acetic acid bacteria. The quality of fermented cocoa beans varies between regions of cocoa producer countries, varieties of cocoa, fermentation methods, drying and cocoa beans storage. The fermentation itself depends on farm practices such as bean selection, mixing of the fermenting mass and the activity of microbes during fermentation. Cocoa bean fermentation is a spontaneous, uncontrolled process that results in end products of variable quality. It is generally known that after 48 h of fermentation, depectinization of pulp and alcoholic fermentation by yeasts is extremely decreased. Until recently it was not known why this occurs. Up to date, the decreasing of yeasts has been most commonly attributed to the physiological adaptation of yeasts to the fermentation environment during fermentation in terms of heat, acid and ethanol tolerance. During the first 24 h of fermentation, yeasts are the dominant species, with Saccharomyces cerevisiae being stably and consistenly present during fermentation. Lactic acid bacteria show dominant growth during 48-72 h of fermentation with the species of Lactobacillus plantarum and Lactobacillus fermentum being dominant. Acetic acid bacteria dominate the last stage of fermentation, where only species of Acetobacter pasterianus remain consistent and stable. Glucose, fructose and citric acid of the pulp are metabolised during fermentation. The metabolic activity of microbes during fermentation produces ethanol, lactic acid, mannitol, acetic acid, as well as heat. Ethanol, acetic acid, lactic acid and heat diffuse into the bean, causing the death of the bean embryo. Further results indicated the presence of microbial diversity between different regions of cocoa bean fermentations. Some species were shown to be present in the cocoa bean fermentations from all investigated regions. Fermented cocoa beans from Ecuador showed the highest diversity of yeasts and lactic acid bacteria compared to Indonesia and Trinidad & Tobago, but the diversity of acetic acid bacteria species was highest in cocoa bean fermentations from Indonesia. Based on the physiological characterization of dominant species from all cocoa bean fermentation regions, the use of Saccharomyces cerevisiae IDI-Y001, Lactobacillus fermentum IDE-L007, and Acetobacter pasteurianus IDI-A019 is suggested as the best combination for use as a starter culture for cocoa bean fermentation process. The development of laboratory fermentation methods showed differences between aerobic and anaerobic methods. Aerobic fermentation methods were characterized by higher organic acid concentrations at the end of fermentation and higher free amino acid concentrations. This is typical for fermented cocoa beans used for the production of chocolate rich in flavour. The anaerobic fermentation method was characterized by lower levels of organic acids and free amino acids, but higher polyphenol concentrations. This is typical for fermented cocoa beans used for the production of healthy chocolate. A novel result of this study is the fact that the seed coat slime of Theobroma cacao L. possesses the ability to inhibit the growth of yeasts and molds. 25 mg mL-1 of seed coat slime inhibit the growth of molds (e.g. Penicillium citrinum, Aspergillus niger, Penicillium purpurogenum) and 10 mg mL-1 seed coat slime inhibit the growth of yeasts (e.g. Saccharomyces cerevisiae, Rhodotorula rubra, Candida lipolytica). Analyses of proteins using nano-electrospray mass spectrometry (Q-TOF II) showed that three proteins have antifungal effect, namely glucanase (33 kDa), chitinase (28.8 kDa) and osmotin (24.1 kDa). The seed coat slime proteins were not stable at 40 and 50 °C for 24 h. Reduction of 90% of pulp can inhibit the growth of the starter culture, specifically growth of the yeasts after 48 h of fermentation, providing the existence of an inhibition by antifungal proteins from the seed coat slime Kakaosamen sind das Rohmaterial fur die Schokoladenproduktion. Diese Samen werden aus den Fruchten des Kakaobaumes (Theobroma cacao L.) gewonnen, der in Plantagen der Aquatorialzone angebaut wird. Dabei stellen die Elfenbeinkuste, Ghana und Indonesien die hauptsachlichen Kakaoproduktionslander dar. Roher Kakao hat einen unangenehmen adstringierenden Geschmack und spontane Fermentationen stellen die erste Stufe in einem Prozess dar, um den charakteristischen Kakaogeschmack und das charakteristische Kakaoaroma zu entwickeln. Die Qualitat der rohen Kakaosamen ist sehr stark von der Nacherntebehandlung, der Fermentation, abhangig. Wahrend der Fermentation der Kakaosamen treten drei Hauptphasen auf: 1) eine anaerobe Fermentation durch Hefen, 2) eine mikroaerophile Fermentation durch Milchsaurebakterien und 3) eine aerobe Fermentation durch Essigsaurebakterien. Die Qualitat der fermentierten Kakaosamen variiert zwischen den Regionen der Kakao produzierenden Lander, den Kakaovarietaten, den Fermentationsmethoden, der Trocknung und der Lagerung der Kakaosamen. Die Fermentation selber hangt von den auf den Farmen durchgefuhrten Verfahren, wie der Auswahl der Samen, der Umwalzung der fermentierenden Masse und der mikrobiellen Aktivitat wahrend der Fermentation, ab. Grundsatzlich ist die Fermentation der Kakaosamen ein spontaner unkontrollierter Prozess, der zu Endprodukten mit unterschiedlicher Qualitat fuhrt. Es ist generell bekannt, dass die alkoholische Garung und der Pektinabbau durch die Hefen nach 48 Stunden Fermentation nachlasst. Die Ursache dafur war bis jetzt unbekannt. Bis jetzt ist man davon ausgegangen, dass die Reduktion der Hefepopulation durch die Fermentationsbedingungen, das heist, durch eine geringe Hitze-, Saure- und Ethanoltoleranz der Hefen verursacht wird. Wahrend der ersten 24 Stunden stellen Hefen die dominanten Spezies dar, wobei Saccharomyces cerevisiae durchgehend stetig bei der Fermentation auftritt. Wahrend eines Zeitraumes von 48 bis 72 Stunden zeigen Milchsaurebakterien ein dominantes Wachstum, wobei die Spezies Lactobacillus plantarum und Lactobacillus fermentum besonders hervortreten. Essigsaurebakterien uberwiegen im letzten Stadium der Fementation wobei die Spezies Acetobacter fermentum stetig und durchgehend auftritt. Wahrend der Fermentation werden durch die Stoffwechselaktivitat der Mikroorganismen Ethanol, Milchsaure, Mannitol, Essigsaure und Warme erzeugt. Durch die Diffusion von Ethanol, Essigsaure und Warme in die Samen hinein wird der Embryo im Samen abgetotet. Weitere Ergebnisse zeigten die mikrobielle Diversitat zwischen unterschiedlichen Regionen auf. Einige mikrobielle Spezies liesen sich in Kakaosamenfermentationen aus allen untersuchten Regionen nachweisen. Fermentierte Kakaosamen aus Ecuador zeigten die hochste Diversitat an Hefen und Milchsaurebakterien im Vergleich zu fermentierten Kakaosamen aus Indonesien und aus Trinidad und Tobago. Demgegenuber war die Diversitat der Essigsaurebakterien aus Kakaofermentationen aus Indonesien am hochsten. Auf der Basis der physiologischen Charakterisierung der dominanten Spezies der untersuchten Kakaofermentationen aus allen drei Regionen wird die Kombination der Stamme Saccharomyces cerevisiae IDI-Y001, Lactobacillus fermentum IDE-L007 und Acetobacter pasteurianus IDI-A019 als die beste Kombination fur eine Starterkultur fur die Kakaofermentation vorgeschlagen. Die Untersuchung von Laborfermentationsmethoden wies Unterschiede zwischen aeroben und anaeroben Verfahren auf. Aerobe Fermentationen wiesen zum Schluss hohere Konzentrationen an organischen Sauren und an freien Aminosauren auf. Dieses ist typisch fur fermentierte Kakaosamen, die fur die Produktion von aromareicher Schokolade benutzt werden. Die anaeroben Fermentationen waren durch niedrige Konzentrationen an organischen Sauren und freien Aminosauren gekennzeichnet, wiesen aber hohere Gehalte an Polyphenolen auf. Dieses ist typisch fur fermentierte Kakaosamen, die fur die Herstellung von Schokolade mit gesundheitlichen Effekten benutzt werden. Ein neues Ergebnis der Arbeit ist die Erkenntnis, dass der Testa-Schleim von Theobroma cacao L. die Fahigkeit besitzt das Wachstum von Hefen und Schimmelpilzen zu inhibieren. 25 mg Testa-Schleim mL-1 inhibieren das Wachstum von Schimmelpilzen (z.B. Penicillium citrinum, Aspergillus niger, Penicillium purpurogenum) und 10 mg mL-1 hemmen das Wachstum von Hefen (z.B. S. cerevisiae, Rhodotorula rubra, Candida lipolytica). Mit Hilfe der Nano-Electrospray-Massen-Spektroskopie konnte gezeigt werden, dass drei Proteinfraktionen aus dem Testa-Schleim einen antimykotischen Effekt haben, namlich Glucanase (33 kDA), Chitinase (28,8 kDa) und Osmotin (24,1 kDa). Es konnte gezeigt werden, dass die Testa-Schleim-Proteine bei Lagerungen uber 24 Stunden bei 40 oC und bei 50 oC nicht stabil waren. Eine Verminderung der Pulpa um 90% kann das Wachstum der Starterkultur inhibieren. Insbesondere wird das Wachstum der Hefen nach 48 Stunden Fermentationszeit inhibiert, was einen Hinweis auf die Hemmung der Hefen durch die antimykotisch wirkenden Proteine des Testa-Schleimes darstellt.