Isolation and structure elucidation of bioactive secondary metabolites of sponge-derived fungi collected from the Mediterranean sea (Italy) and Bali sea (Indonesia)

Aus 79 schwammassoziierten Pilzstammen, isoliert von aus Elba (Italien) und Westbali (Indonesien) stammenden Schwammen, wurden aufgrund der Ergebnisse eines Bioaktivitatscreenings funf Stamme zur weiteren Bearbeitung ausgewahlt. Die Proben wurden vor Ort von Tauchern gesammelt und spater im Alfred Wegener Institut (AWI) fur Marine und Polare Okologie, Bremerhaven, und im Institut fur Pharmazeutische Biologie, Heinrich-Heine Universitat, Dusseldorf, Deutschland, kultiviert. Penicillium sp. sowie Verticillium cf cinnabarium wurden von dem aus Elba stammenden Schwamm Ircinia fasciculata isoliert, Fusarium sp. von Axinella damicornis (ebenfalls aus Elba) und Lecanicillium evansii 1 und 2 aus den westbalineschen Schwammen Callyspongia sp. and Hyrtios sp. Das Bioaktivitatscreening, das zur Auswahl dieser funf Stamme fuhrte, beinhaltete die Untersuchung ihrer Wirkung auf brine shrimp (Artemia salina), Insekten (Spodoptera littoralis) und ihrer antimikrobiellen Aktivitat [grampositive Bakterien (Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus), gramnegative Bakterien (Escherichia coli), und drei Pilze (Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Cladosporium herbarum)]. Bei der Auswahl dieser Stamme zur weiteren Bearbeitung wurden weiterhin die Verteilung der aus den ESI-MS Spektren zur entnehmenden Molekulargewichte und die Einzigartigkeit der UV Spektren der im jeweiligen Rohextrakt enthaltenen und in der HPLC sichtbaren Verbindungen berucksichtigt. Die Kultivierung der Stamme 1, 2, und 3 in Form von 10 l Standkulturen in Wickerham Medium sowie deren taxonomische Einordnung wurden am AWI vorgenommen. Die Stamme 4 und 5 wurden durch das Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, die Niederlande identifiziert und erwiesen sich als neue Spezies. Diese beiden Stamme wurden in Standkulturen in Wickerham Medium am Institut fur Pharmazeutische Biologie, der Heinrich-Heine Universitat Dusseldorf, kultiviert. Insgesamt 31 Verbindungen konnten nach Extraktion der Kulturen und Isolierung der gebildeten Sekundarstoffe aufgeklart werden. Sechs dieser Verbindungen wurden von Penicillium sp. isoliert. Es waren Anthrachinone (Emodin, Hydroxyemodin), ein Alkaloid (Meleagrin), ein Bipeptid (Cyclo-leucylprolyl) und Triterpene (Citreohybridonol, Andrastin A). Acht weitere Verbindungen stammen aus Verticillium cf cinnabarium, darunter einfache aromatische Verbindungen (3-Hydroxyanthranilicsaure, 4-Hydroxybenzaldehyd, Tyramin), Bipeptide (Cyclo-alanyltryptophan, Cyclo-prolylvalyl, Cyclo-leucylprolyl), ein Alkaloid (Verticillin B) und ein Steroid (Lichesterol). Drei Verbindungen (das Steroid Ergosterolperoxid, ein Triterpenacetat und ein Cerebrosid) konnten aus Fusarium sp. isoliert werden. Die zwei neuen Stamme von L. evansii enthielten sehr verschiedenartige Metabolite. Dies fiel bereits durch das Verteilungsmuster der einzelnen Peaks in der HPLC der Rohextrakte auf und konnte spater bestatigt werden. Beide Stamme von L. evansii schienen in einem Medium ohne Zusatz von Meersalz zunachst viel schneller zu wachsen. Nach sieben Tagen des Wachstums waren jedoch keine merklichen Unterschiede hinsichtlich der Farbe und Dichte des Myzels mehr zu erkennen. Die Oberflache jedes Kulturmediums war vollstandig von dem weisen Myzel bedeckt. Die L. evansii Kultur (Stamm 2), die ohne den Zusatz von Meersalz gezuchtet wurde, enthielt eine grosere Bandbreite an Sekundarstoffen, was durch die Anzahl an Peaks im HPLC-Spektrum belegt werden konnte. Fur Stamm 1 traf dies jedoch nicht zu. Aus L. evansii (Stamm 1) konnten sieben Verbindungen isoliert werden, darunter phenolische Verbindungen (Terphenylin, Deoxyterphenylin, Terprenin 2, Terpreninepoxid), ein Bipeptid (Cyclo-tyrosylprolyl) und einfache aromatische Verbindungen (Acetylhydroxybenzamid, 4-Hydroxy-benzaldehyd). Stamm 2 von L. evansii enthielt sieben Verbindungen: Nukleoside (Cytosinribosid, Cytosin deoxyribosid, Adenosinribosid, Adenosindeoxyribosid), Steroide (Ergosterolperoxid, Dehydro-ergosterolperoxid), und ein Cerebrosid C. Unter diesen Verbindungen befinden sich auch vier neue Naturstoffe (ein Triterpenacetat, Deoxyterphenylin, Terprenin 2, und Terpreninepoxid). Bei dem Triterpenacetat handelt es sich aufgrund des Vorhandenseins einer Hydroxyl-Gruppe in Position 2 um eine neue Verbindung im Gegensatz zu ahnlichen bereits bekannten Verbindungen. Bereits 100 µg Triterpenacetat zeigten eine starke Aktivitat gegen S. aureus. Der Hemmhof zeigte eine Grose von 7 mm im Durchmesser. Auserdem konnte eine cytotoxische Wirkung auf menschliche Krebszelllinien festgestellt werden mit einer Wachstumshemmung von 91.25% (JURKAT), von 36.00% (THP-1) und von 85.67% (MM-1). In dem neuen Deoxyterphenylin befindet sich eine Methoxygruppe in Position 4? im Gegensatz zu der bereits bekannten Verbindung, wo sie sich in Position 2? befindet. Die ungewohnliche Prenylseitenkette, die in Position 3 direkt an den Phenylring gebunden und nicht wie sonst uber einen Sauerstoff verbunden ist, ist ein Charakteristikum fur das neue Terprenin 2. In dem neuen Terpreninepoxid befindet sich der Epoxidfunktion in der Seitenkette.