麩胺酸生產菌 Corynebacterium glutamicum 之基因工程改良俾應用於麩醯胺酸之生產

麩醯胺酸 (glutamine) 對人體為非必需胺基酸 (nonessential amino acid)，但近年來研究指出重症患者、運動員、手術後的病患及成長的嬰兒對麩醯胺酸有大量的需求，得由飲食補充，因此麩醯胺酸被視為 「條件性必需胺基酸」。Corynebacterium glutamicum 為麩胺酸之工業生產菌。在 C. glutamicum中，由 glutamate dehydrogenase (GDH，gdh) 催化形成麩胺酸，而由 glutamine synthetase (GS，glnA) 催化麩胺酸形成麩醯胺酸，故提升 GS 活性應可增加麩醯胺酸之產量。本研究利用基因工程技術改造 C. glutamicum 使其大量產生麩醯胺酸，有研究指出 glnE 與 glnK 基因產物會抑制 GS 的活性而 pks13 基因產物則會影響菌體的滲透性。為提升 GS 活性，首先利用同源性基因互換方式分別破壞 glnE、glnK 及 pks13 三個基因，得到 DglnE、DglnK 及 Dpks13 三種轉形菌株，分析其 GS 活性發現 DglnE 之 GS 活性比野生菌株提升 0.7 倍，DglnK則下降 50％，而 Dpks13 之 GS 活性並無明顯差異。另外，以質體形式增加 glnA 基因套數後，發現轉形株 GS 活性無明顯提升。再利用 16S rDNA 之同源性嵌入 gdh 基因得到 Intgdh 轉形株，發現其 GDH 活性提昇約六倍。將 glnA 進行定點突變 (Y405F) 使 GS 不受 adenylylation 抑制，再將質體pSUM-glnAY405F 轉形入 DglnE，結果顯示轉形株之 GS 活性約提高 3.5 倍。此外，將 Intgdh 轉形株之 glnE 基因破壞並嵌入 glnAY405F 基因，結果顯示 GS 活性提升 1.2 倍。將轉形株以 PM 培養基進行長時間的浸漬培養，並分析其麩醯胺酸的濃度。結果發現 DglnE 轉形株於培養 48 小時後麩醯胺酸濃度為 11 mM，GS 活性最高之 DglnE (pSUM-glnAY405F) 轉形株的生產濃度只有 2.4 mM，而野生株則有 1.5 mM。DglnE 轉形株之 GS 活性雖然僅提高 0.7 倍，但麩醯胺酸濃度卻提高了 8 倍，而送入 pSUM-glnAY405F 之轉形株，雖然 GS 活性提升 3.5 倍，但麩醯胺酸產量僅提高 1.5 倍。本研究結果顯示 GS 酵素活性與麩醯胺酸產量並無絕對之相關性。