Evaluation of transgenic grapevine lines overexpressing Vv-AMP1 antifungal peptide

Die belang van klein antimikrobiese peptiede in die ingebore immuunstelsel van plante het tydens die afgelope dekade toenemend duidelik geraak.Antimikrobiese peptide is unieke en diverse molekules wat in verskeie weefseltipes in 'n verskeidenheid van invertebraat-, plant-en dierspesies gevind word.Baie van hierdie peptiede, soos bv."plant defensins", word bevind om alomteenwoordig in die plantryk te wees en is reeds geïsoleer vanuit blomme, blare, wortels, sade, saailinge, peule, knolle en bas.Die toenemende belang van antimikrobiese peptiede (insluitend "plant defensins") in navorsing kan grootliks toegeskryf word aan hul breë-spektrum antifungiese aktiwiteit.Hierdie eienskap maak hul belowende potensiële teikens, beide as terapeutiese middels asook vir gebruik in gewasbeskerming en siekteweerstand.Die voortdurende ontdekking van nuwe antimikrobiese peptiede bevorder tans die ontwikkeling van strategieë om hierdie gene in plante uit te druk in 'n poging om die plant se natuurlike vermoeë om patogeniese aanval teen te staan te verbeter.Die eerste wingerd antifungale peptied, Vv-AMP1, is geïsoleer en gekarakteriseer as 'n ontwikkelings-gereguleerde peptied wat slegs uitgedruk word in korrels, tydens die aanvang van bessie rypwording.Die peptied het tydens in vitro toetse sterk antifungale aktiwiteit getoon teen 'n verskeidenheid plant-patogeniese swamme.In hierdie studie word die biologiese rol van die Vv-AMP1 peptied verder ondersoek, beide binne sy natuurlike gasheerplant, (Vitis vinifera) asook onder in vitro kondisies teen 'n paneel van wingerd-spesifieke patogene.As 'n beginpunt is rekombinante produksie van Vv-AMP1 met behulp van 'n bakteriële ekspressie sisteem evalueer en die hetereloë produksie van die Vv-AMP1 peptied stelselmatig verbeter.Spesifieke optimerings het gefokus op beide die produksie en suiwering van die peptied en het die algehele opbrengs van Vv-AMP1 verhoog.Spesifieke stappe wat in die produksieproses vir verbetering geteiken is sluit beide induksietoestande van peptiedproduksie deur die bakteriële kultuur in sowel as 'n aantal suiweringsstappe, soos lisaatvoorbereiding, bindingskondisies, kolom wasstappe, eluasie kondisies en "thrombin" protease snyding in.Die optimale suiweringsmetode het tot 3 mg suiwer Vv-AMP1 peptied opgelewer vanaf 'n 1.6 L oornag bakteriële kultuur.Hoewel die produksie van die peptide noemenswaardig verbeter is, was die gesuiwerde Vv-AMP1 beide onaktief en struktureel onstabiel.Dit is buitengewoon vir hierdie peptied, wat daarop dui dat belangrike aspekte benodig vir antifungiese aktiwiteit, soos korrekte vou of die teenwoordigheid van spesifieke kofaktore, moontlik ontbreek in hierdie nie-gasheer prokariotiese produksiesisteem.Die studie het ook die karakterisering en evaluering van die Vv-AMP1 peptied teen 'n paneel van wingerd-spesifieke patogene wat kultureerbaar is en sporuleer, insluitend in vitro antifungale toetse en mikroskopiese analise, behels.Vv-AMP1 toon sterk inhiberende aktiwiteit teen alle patogene getoets.Dit inhibeer die groei van Diplodia seriata en Cylindrocarpon liriodendri met 50% teen konsentrasies tussen 4.8 µg/ml en 9.6 µg/ml.Phaemoniella chlamydospora en Phomopsis viticola was besonders sensitief, met IC 50 waardes van 5.5 µg/ml en 4.0 µg/ml, onderskeidelik.Mikroskopiese analise van die effek van die Vv-AMP1 peptied op P. viticola het 'n ernstige inhibisie op swam ontkieming en groei aangedui.Die peptied het geen morfologiese veranderinge in swam hifes veroorsaak nie maar het wel die swam membraan beskadig.Hierdie bevinding ondersteun die teorie dat die peptied membraan permeabilisasie induseer.Funksionele analise van 'n transgeniese V. vinifera (cv.Sultana) populasie wat die Vv-AMP1 geen ooruitdruk is by die studie ingesluit om 'n geleentheid te bied om die in planta rol van die peptide binne sy natuurlike gasheerplant te bestudeer.Die genetiese karakterisering van die vermeende transgeniese bevolking het die bevestiging van beide geenintegrasie en kopiegetal deur PKR en Southern-klad analise ingesluit, sowel as geenuitdrukking d.m.v.noordelike-klad analise.'n Bevestigde transgeniese bevolking is evalueer vir potensiële verbeterde weerstand (in vergelyking met die wilde tipe) deur infeksie met Botrytis cinerea as 'n eerste toetsorganisme in 'n poging om 'n weerstandbiedende fenotipe met die ooruitdrukking van Vv-AMP1 te assosieer.Waarnemings van letsel tipe, letsel grootte en verdere statistiese analise het tot die gevolgtrekking gelei dat die transgeniese bevolking 'n definitiewe (dog geringe) verbeterde weerstand toon in vergelyking met die ongetransformeerde lyne.Ten slotte bepaal die studie dat Vv-AMP1 'n sterk antifungale effek teen wingerdspesifieke patogene toon tydens in vitro toetse.'n Definitiewe korrelasie is vasgestel tussen die ooruitdrukking van Vv-AMP1 in wingerd en 'n weerstandsfenotipe in die transgeniese bevolking.Die gekarakteriseerde transgeniese bevolking is uiteraard belangrik vir toekomstige werk om die in planta aktiwiteit van die peptied te evalueer teen verdere wingerdpatogene soos bv.die stampatogene wat sensitief getoets het teen die peptide, asook patogene wat nie kultureerbaar is nie, insluitend verpligte patogene soos dons-en poeierskimmel.