Έκφραση και ρόλος της aggrecan και perlecan στο πρώιμο έμβρυο

Η ανάπτυξη του εμβρύου καθορίζεται από τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ κυττάρων και εξωκυττάριας ύλης. Στην εξωκυττάρια ύλη περιέχονται πρωτεογλυκάνες, εκ των οποίων οι perlecan και aggrecan είναι από τις πρώτες που εκφράζονται στο πρώιμο έμβρυο. Λίγα είναι γνωστά για την έκφραση και τον ρόλο τους κατά την ανάπτυξη του πρώιμου εμβρύου των σπονδυλωτών. Μελετήσαμε τη χωρο-χρονική κατανομή των perlecan και aggrecan με RT-PCR, ανοσοφθορισμό και ανοσοκατακρήμνιση από το στάδιο Χ (μορίδιο) έως το στάδιο ΗΗ17 (29-32 σωμίτες) στο πρώιμο έμβρυο όρνιθας. Επιπρόσθετα, μελετήσαμε το ρόλο των perlecan και aggrecan με τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι αυτών κατά την ανάπτυξη του πρώιμου εμβρύου.Η perlecan είναι μια πολυδιάστατη πρωτεογλυκάνη θειϊκής ηπαράνης η οποία αληλεπιδρά με αυξητικούς παράγοντες, άλλα μόρια της εξωκυττάριας ύλης και με μόρια της κυτταρικής επιφάνειας. Η perlecan πρωτο-ανιχνεύτηκε στο στάδιο του μοριδίου (στάδιο Χ) μόλις πριν τη συναρμολόγηση της πρώτης βασικής μεμβράνης που σχηματίζεται στο πρώιμο έμβρυο. Ο φθορισμός για την perlecan ήταν έντονος στα κύτταρα της επιβλάστης που μεταναστεύουν μέσα από την πρωτογενή αύλακα στο στάδιο ανάπτυξης ΗΗ3-4 (γαστρίδιο) για να αποικήσουν τις τρεις βλαστικές στοιβάδες. Στο στάδιο ΗΗ10-11 (12 σωμίτες) η perlecan ανιχνεύεται με υψηλή ένταση στα νευροεπιθηλιακά κύτταρα των μυελεγκεφάλου, διεγκεφάλου, νευρικού σωλήνα και της νωτοχορδής όμως τα επίπεδα της είχαν μειωθεί αισθητά στο νευροεπιθήλιο και υψηλή ένταση φθορισμού ανιχνεύτηκε στις βασικές μεμβράνες των οργάνων αυτών στο στάδιο ΗΗ17 (29 σωμίτες). Τα κύτταρα των νευρικών κρηπίδων πριν αλλά και κατά τη διάρκεια της μετανάστευσης εκφράζουν έντονα perlecan. Ο φθορισμός για την perlecan ήταν έντονος στο μεσονεφρό, στο θύμο αδένα και στις καταβολές του πνεύμονα στο στάδιο ΗΗ17. Στον οφθαλμό, μεγάλη ήταν η ένταση φθορισμού για την perlecan στο φακό και ειδικότερα στη βασική μεμβράνη που είναι σε γειτνίαση με το παρακείμενο του εξώδερμα (μελλοντικός κερατοειδής χιτώνας/prospective cornea) και στον αμφιβληστροειδή χιτώνα, μεταξύ της χρωματοφoρούχου και αισθητήριας στοιβάδας του αμφιβληστροειδή χιτώνα. Η παρουσία της perlecan ήταν έντονη σε όλη την έκταση της αναπτυσόμενης καρδιάς. Η συναθροισμένη εξωκυττάρια ύλη επέδειξε εξαιρετικά έντονο φθορισμό για την perlecan σε όλα τα στάδια ανάπτυξης που μελετήθηκαν Το ειδικό αντίσωμα έναντι της αυτής κατακρήμνισε νέο-συντιθέμενη πρωτεΐνη με μοριακή μάζα περίπου στα 400 kDa. Για τη μελέτη του ρόλου της perlecan χρησιμοποιήσαμε μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της perlecan σε έμβρυα στα στάδια ανάπτυξης ΧΙ (μορίδιο) και ΗΗ3 (γαστρίδιο). Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι η perlecan δεν απαιτείται για τα αρχικά στάδια επαγωγής του μεσοδέρματος αλλά φαίνεται να είναι σημαντική στην μετέπειτα αναπτυξιακή του πορεία (πολλαπλασιασμός καρδιακών κυττάρων, πολλαπλασιασμός κυττάρων των σωμιτών, κατάτμηση και επιθηλιοποίηση του παρα-αξονικού μεσοδέρματος) και επίσης στη μορφογένεση οργάνων όπως ο νευρικός σωλήνας, η καρδιά και η ραχιαία αορτή. Η perlecan που αλληλεπιδρά με αυξητικούς παράγοντες και τους υποδοχείς τους συμμετέχει στα μονοπάτια μεταγωγής σήματος που ρυθμίζουν τις μορφογενετικές κινήσεις της γαστριδίωσης, της μετανάστευσης των κυττάρων των νευρικών κρηπίδων, τον πολλαπλασιασμό και επιβίωση των κυττάρων και τη κατάτμηση του παρα-αξονικού μεσοδέρματος (σωμίτες). Η aggrecan φέρει αλυσίδες θειϊκής χονδροιτίνης και θειϊκής κεράτανης και σχηματίζει μεγαλομοριακά συμπλέγματα με το υαλουρονικό οξύ μέσω της συνδετικής πρωτεΐνης. Αναστέλει δραστικά την προσκόλληση των νευρώνων και την προέκταση των αξόνων τους αλλά και τη μετανάστευση των κυττάρων των νευρικών κρηπίδων και για αυτό έχει χαρακτηριστεί ως απωθητική/ αντιπροσκολλητική πρωτεογλυκάνη. Ανιχνεύσαμε την aggrecan για πρώτη φορά στο στάδιο του βλαστιδίου (στάδιο ΧΙΙΙ) και η παρουσία της φαίνεται να είναι καθοριστικής σημασίας στη δημιουργία του βλαστόκοιλου, της πρώτης εμβρυϊκής κοιλότητας, στο στάδιο αυτό. Σε έμβρυα στο στάδιο ΗΗ3 (ενδιάμεσο γαστρίδιο) κύτταρα της επιβλάστης που μεταναστεύουν μέσα από την πρωτογενή αύλακα έδειξαν έντονη σήμανση για την aggrecan. Στο στάδιο ΗΗ4 (προχωρημένο γαστρίδιο) ο φθορισμός για την aggrecan παρουσιάζει ένταση στη νευρική πλάκα και στην συναθροισμένη εξωκυττάρια ύλη μέσα στις κοιλότητες εκατέρωθεν της νευρικής πλάκας. Στα έμβρυα στο στάδιο ΗΗ13 (19 σωμίτες), η aggrecan ανιχνεύτηκε σε υψηλά επίπεδα σε όλο το νευροεπιθήλιο του νευρικού σωλήνα και της νωτοχορδής όμως μέχρι το στάδιο ΗΗ17 (29 σωμίτες) η aggrecan είχε μειωθεί στο νευροεπιθήλιο και έδειχνε ένταση φθορισμού στο περίγραμμα των εσωτερικών τοιχωμάτων του τελεγκεφάλου και του νευρικού σωλήνα και στην περιφέρεια της νωτοχορδής. Ένταση φθορισμού για την aggrecan ανιχνεύτηκε στο δερμομυοτόμo αλλά όχι στο σκληροτόμο στο σωμίτη στα στάδια ανάπτυξης ΗΗ13 και ΗΗ17. Η ένταση φθορισμού για την aggrecan στο μυοκάρδιο, ενδοκάρδιο και στην εξωκυττάρια ύλη της αναπτυσσόμενης καρδιάς στο στάδιο ΗΗ17 φανερώνει ότι η aggrecan μπορεί να συμμετέχει στην μορφογένεση της καρδιάς. Επιπρόσθετα στο στάδιο ΗΗ17, πολύ έντονο φθορισμό φανέρωσαν τα κύτταρα των νευρικών κρηπίδων που μεταναστεύουν και τα τοιχώματα της ραχιαίας αορτής και του εντέρου. Για τη μελέτη του ρόλου της aggrecan χρησιμοποιήσαμε μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι αυτής σε έμβρυα που βρίσκονταν στα στάδια της γαστριδίωσης ΗΗ1 (μόλις πριν την έναρξη των μορφογενετικών κινήσεων της γαστριδίωσης) και ΗΗ3 (ενδιάμεσο γαστρίδιο). Η αναστολή της δράσης της aggrecan προκάλεσε ανωμαλίες στην αρχιτεκτονική των ιστών και τη φυσιολογική μορφογένεση του εγκεφάλου, της καρδιάς, της ραχιαίας αορτής, της νωτοχορδής και των σωμιτών. Οι perlecan και aggrecan έχουν μοναδικές ιδιότητες και λειτουργίες κατά την ανάπτυξη του πρώιμου εμβρύου. Ο ρόλος της perlecan φαίνεται να είναι σημαντικός στη δόμηση βασικών μεμβρανών, στην επιθηλιοποίηση ιστών και στη διαθεσιμότητα αυξητικών παραγόντων. Ο ρόλος της aggrecan σε συνεργισμό με την συνδετική πρωτεΐνη και το υαλουρονικό οξύ φαίνεται να είναι σημαντικός στη δημιουργία και τη διατήρηση της αρχιτεκτονικής των εμβρυϊκών κοιλοτήτων και στη δημιουργία διόδων για την μετανάστευση κυττάρων και την οργανογένεση.