The secreted lipase FGL1 of the phytopathogenic fungus Fusarium graminearum (teleomorph Gibberella zeae (Schwein.) Petch) is a novel virulence factor and suppresses plant defense in Triticum aestivum (L.)

Fusarium graminearum is the causal agent of the Fusarium head blight (FHB) and a destructive pathogen of cereals accounting for extreme grain yield losses especially on wheat and maize. Like other fungal pathogens, F. graminearum secretes various extracellular enzymes, which are hypothesized to be involved in host infection. Extracellular lipolytic activity of F. graminearum was strongly induced in culture by wheat germ oil; this made it possible to isolate, clone, and characterize a gene (FGL1) which codes for a secreted lipase. Expression analysis indicated that FGL1 is induced by lipid-containing substrates and repressed by glucose. In planta, FGL1 transcription was detected one day post infection of wheat spikes. The function of the FGL1 gene product was verified by specifically demonstrating lipase activity after expression in a heterologous host. Ebelactone B, a known lipase inhibitor, repressed the lipolytic activity of the enzyme. Disease severity was strongly reduced when wild-type conidia were supplemented with ebelactone B. Transformation-mediated disruption of FGL1 led to reduced extracellular lipolytic activity in culture and to reduced virulence to both wheat and maize. Wheat infection with delta-fgl1 strains was associated with a strong barrier formation in the spike, impeding the fungus from spreading further (type II resistance). Callose ((1,3)-beta-glucan) is a main component of papillae. These are barriers that are considered to delay pathogenic spreading. The class of glucan synthase-like (GSL) genes represents an appropriate target to analyze the regulation of callose synthesis. The expression of eight GSL genes (TaGSL) was analyzed as well as callose synthase activity and total callose content in the stem, leaf blade and spike of wheat. Organ-specific expression of six TaGSL genes and strong differences in expression levels were detected by quantitative real-time PCR. Differences were also determined in callose synthase activity and the total amount of callose in the examined organs. Aniline blue staining in tissue sections localized callose depositions. These data suggests that callose synthesis is highly regulated by a combination of GSL genes, which are involved either in general or organ-specific developmental processes. Therefore, the callose content, callose synthase activity and GSL gene expression were examined during fungal infection. Wheat spikes were inoculated with F. graminearum wild type, a delta-fgl1 strain, and Pyrenophora teres to induce non-host reactions. A strong inhibition of callose synthase activity was observed during F. graminearum wild-type infection. Contrarily, enzyme activation was induced during delta-fgl1 and P. teres infection. The addition of unsaturated free fatty acids (FFA) to spikelets three days post inoculation significantly increased the virulence of delta-fgl1. Thus, the release of FFA due to fungal lipase activity is necessary for full infection the host plant. Differences in inhibition of callose synthase activity by FFA of both a susceptible and a resistant wheat cultivar contribute to type II resistance in wheat. Thus, a model for type II resistance to fungal infection in wheat has been proposed in this study. Fusarium graminearum ist der Hauptverursacher von Ahrenfusariosen und zeigt sein zerstorerisches Potential gegenuber Getreide durch hohe Ernteverluste, insbesondere bei Weizen und Mais. Wie auch andere pathogene Pilze sekretiert F. graminearum zahlreiche extrazellulare Enzyme, von denen vermutet wird, an der Infektion der Wirtspflanze beteiligt zu sein. Die extrazellulare lipolytische Aktivitat von F. graminearum wurde besonders stark durch Weizenkeimol induziert. Dies ermoglichte die Isolierung, Klonierung und Charakterisierung eines Gens (FGL1), das eine sekretierte Lipase kodiert. Untersuchungen zeigten, dass die Expression von FGL1 durch lipidhaltige Substrate induziert und durch Glukose reprimiert wird. In planta wurden FGL1-Transkripte bereits einen Tag nach der Infektion von Weizenahren nachgewiesen. Die Funktion des FGL1-Genproduktes wurde durch die spezifische Lipaseaktivtitat nach der Expression in einem heterologen Wirt nachgewiesen. Neben einer Unterdruckung der lipolytischen Aktivitat der Lipase wurde auch der Krankheitsgrad auf Weizenahren deutlich reduziert, wenn Wildtypkonidien zuvor mit dem bekannten Lipaseinhibitor Ebelacton B versetzt wurden. Als Folge einer transformationsvermittelten Disruption des FGL1-Gens wurden eine verminderte extrazellulare lipolytische Aktivitat in Kulturuberstanden und eine reduzierte Virulenz gegenuber Weizen und Mais festgestellt. Die Infektion von Weizen mit delta-fgl1-Stammen war mit der Bildung von Barrieren in der Ahre begleitet, die eine weitere Ausbreitung des Pilzes (Typ II-Resistenz) verhinderten. Callose ((1,3)-beta-Glukan) ist die Hauptkomponente von Papillen, die als Barrieren angesehen werden, um eine Ausbreitung des Pathogens zu verzogern. Fur die Analyse der Callosesynthese-Regulation eignet sich die Gruppe der Glukansynthase-ahnlichen (glucan synthase-like, GSL) Gene. Hierzu wurde die Expression von acht GSL-Genen (TaGSL) sowie die Callosesynthase-Aktivitat und die Gesamt-Callosemenge im Stamm, der Blattscheide und der Ahre von Weizen untersucht. Mit Hilfe der quantitativen real-time PCR wurden sowohl eine organspezifische Expression von sechs TaGSL-Genen als auch starke Unterschiede im Expressionsniveau nachgewiesen. Zudem unterschieden sich die Callosesynthase-Aktivitat und Gesamt-Callosemenge in den untersuchten Organen. Das Farben von Gewebeschnitten ermoglichte das Lokalisieren von Calloseanlagerungen. Diese Ergebnisse lassen darauf schliesen, dass die Callosesynthese durch die Kombination der verschiedenen GSL-Gene, die entweder an generellen oder organspezifischen Entwicklungsprozessen beteiligt sind, ein hochgradig regulierter Prozess ist. Nachfolgend wurde die GSL-Genexpression, Callosesynthase-Aktivitat und Gesamt-Callosemenge wahrend der Pilzinfektion analysiert. Dazu wurden Weizenahren mit F. graminearum Wildtyp, einem delta-fgl1-Stamm und Pyrenophora teres, zum Hervorrufen von Nicht-Wirtsreaktionen, inokuliert. Eine starke Inhibierung der Callosesynthase-Aktivitat wurde wahrend der F. graminearum Wildtyp-Infektion beobachtet. Im Gegensatz dazu wurde die Enzymaktivitat wahrend der delta-fgl1- und P. teres-Infektion induziert. Die Zugabe von ungesattigten freien Fettsauren (FFS) zu Ahrchen drei Tage nach der Inokulation fuhrte zu einem Anstieg der Virulenz des delta-fgl1-Stammes. Daraus ergibt sich, dass das Freisetzen von FFS durch die Lipaseaktivitat des Pilzes fur eine volle Infektion der Wirtspflanze notwendig ist. Die unterschiedlich starke Inhibierung der Callosesynthase-Aktivitat durch FFS in einem anfalligen und einem resistenten Weizenkultivar tragen zur Auspragung der Typ II-Resistenz in Weizen bei. Ein Model zur Typ II-Resistenz gegenuber einer pilzlichen Infektion in Weizen fasst die erhaltenen Ergebnisse zusammen.