Molecular characterization of a novel segmented dsRNA mycovirus and its association with hypovirulence of Fusarium graminearum.

Zehn Fusarium graminearum (F. graminearum) Isolate aus China wurden auf die Anwesenheit von dsRNA und damit Mycoviren gescreent. Eines von ihnen, namlich F. graminearum China 9 enthielt 5 dsRNA Segmente nach Agarosegelelektrophorese mit Grosen von 2,4 bis 3,5 Kb. Isometrische Viruspartikel von etwa 40 nm wurden erfolgreich durch CsCl-Gradienten Zentrifugation gereinigt und konnten unter dem Transmissionselektronenmikroskop beobachtet werden. Als Teil dieser Studie, wurden PCR-basierte Methoden fur die Bestimmung der Sequenzen der dsRNA Segmente optimiert. Diese Methoden umfassten random PCR (rPCR), Single Primer Amplification Techinque (SPAT) und Full Lenght Amplifikation der cDNA (FLAC). Sequenzen, durch rPCR lieferten Teilinformationen von vier der viralen genomischen Segmente. Daruber hinaus erlaubten die modifizierten Versionen der SPAT und FLAC Methoden die Amplifikation voller Lange Segmente fur die meisten der viralen dsRNA mit einer einzigen RT-PCR. In einem weniger effizienten Ansatz wurden virale Sequenzen bis zu 2,2 kb Lange durch Klonieren gereinigter dsRNA-Segmente direkt in DNA-Vektoren erhalten. Mit diesen Methoden wurden die funf dsRNA Segmente von F. graminearum Mycovirus China 9 (FGV-ch9) vollstandig sequenziert. In jedem Segment wurde ein einziger ORF identifiziert. BLAST Ergebnisse zeigten, dass die dsRNA1 konservierte RdRP Motive beinhaltet. Das dsRNA2 Segment ahnelt dem hypothetischen Protein von dsRNA3 des Magnaporthe oryzae chrysovirus 1. Fur die dsRNA4 konnten keine signifikanten Ahnlichkeiten zu bekannten Proteinen nachgewiesen werden. Fur das dsRNA5 Segment konnte eine C2H2 Zinkfinger-Domane im C-terminalen Bereich identifiziert werden. Tandem Massenspektrometrie, Ober-flachenprotein-spezifische in vitro-Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen von gereinigten VLPs und SDS-PAGE, sowie Protein BLAST Ergebnisse belegen, dass drei Segmente des Virus Strukturproteine sind. Moglicherweise kodiert die dsRNA3 fur das Kapsidprotein. Ergebnisse von relativen quantitativen PCR Untersuchungen der Mengenverhaltnisse der funf dsRNAs aus gereinigten VLPs fuhrten zur Hypothese, dass die Segmente einzeln in ungleichen Mengen verpackt werden. Die genomische Organisation des Virus und phylogene-tische Untersuchung basierend auf der RdRP und dem Kapsidprotein unterstutzen in hohem Mase die Zugehorigkeit von FGV-ch9 zur Familie der Chrysoviridae, und wo es moglicherweise die Typspezies einer neuen Gattung darstellt. Kulturen aus vereinzelten Konidien von F. graminearum China 9 wurden in drei Kategorien auf der Basis ihre Assoziation mit verschiedenen Mengen von FGV-ch9 dsRNAs gruppiert. Dabei waren moderate und hohe Virustiter von FGV-ch9 mit Hypovirulenz in China 9 verbunden. Dies umfasste desorganisierte Zytoplasmastrukturen mit grosen Vakuolen und Membran-gebundenen Strukturen, abnorme Koloniemorphologie mit eingeschranktem Wachstum, reduzierte Konidienproduktion, Unfahigkeit Perithecien zu bilden, und verminderte Virulenz des Pilzes fur Weizen und Maispflanzen. Um zu uberprufen, ob diese Phanotypen auf direkter Interaktion mit FGV-ch9 beruhen, wurde ein virusfreies F. graminearum Isolat, PH1-GB, mit gereinigten Virus-ahnliche Partikel (VLP) transfiziert. Die Ergebnisse zeigten, dass FGV-ch9 transfizierte Kulturen des PH1-GB eine um 10 – 50% reduzierte Pathogenitat fur Weizen und 20-30% fur Mais, eine deutliche Verringerung ihrer Kapazitat, Konidien zu produzieren (> 90%) und eine funffache Reduktion der Perithecienbildung aufwiesen. Co-Inokulation von Maispflanzen mit China9 und PH1-GB ergab eine dreifache Reduktion der Zahl erkrankter Korner. Wenn die Genprodukte von FGV-ch9 dsRNA2, 3, 4 oder 5 konstitutiv in Zellen des PH1-GB exprimiert wurden, war eine Reduktion der Konidienproduktion um 50-90% dieser Zellen zu beobachtet. Daruber hinaus zeigten die Ergebnisse, dass die Gene, die von dsRNA2, 3 und 4 kodiert werde, die Pathogenitat von PH1-GB fur Weizen um 42, 40, 54% und fur Mais um 46, 44, 38% reduzierten. Die Uberexpression des Gens von dsRNA5 fuhrte zu einer weniger auffalligen Wirkung in beiden Pflanzen. Diese Ergebnisse unterstutzen die Hypothese, dass FGV-ch9 mit Hypovirulenz von F. graminearum korreliert ist, und somit eine mogliche Methode fur die Kontrolle der Krankheiten darstellt, die durch Fusarium graminearum an Getreide hervorgerufen werden. Ten Fusarium graminearum (F. graminearum) isolates from China were screened for the presence of dsRNA mycoviruses. One of them, namely F. graminearum China 9 showed 5 dsRNA segments after agarose gel electrophoresis with sizes ranging from 2.4 to 3.5 Kb. Isometric Virus-Like particles (VLPs) of about 40 nm were successfully purified by means of CsCl equilibrium-centrifugation and observed under the Transmission Electron Microscope. As part of this study, several PCR-based methods for the sequence determination of dsRNA templates were optimized. These methods include random PCR (rPCR), Single Primer Amplification Techinque (SPAT), and Full Length Amplification of cDNA (FLAC). Sequences obtained by the rPCR revealed partial information of 4 of the virus genomic segments. Moreover, the modified versions of the SPAT and FLAC methods allowed the amplification of full-length segments representing all or part of the viral dsRNAs in a single RT-PCR. In a less efficient approach, viral sequences up to 2.2 kb in length were obtained by cloning purified dsRNA segments directly into DNA vectors. Using the above methods, the 5 dsRNA segments of F. graminearum mycovirus china 9 (FgV-ch9) were completely sequenced and a single ORF per segment was identified. BLAST results showed that dsRNA1 possess RdRP conserved motifs, dsRNA2 resembles the hypothetical protein encoded by dsRNA3 of Magnaporthe oryzae chrysovirus 1, dsRNA4 share no significant similarity to any published protein, and dsRNA5 has a C2H2 zinc finger domain. Tandem Mass Spectrophotometry, surface protein labeling of purified VLPs, SDS-PAGE, and protein BLAST results support that three of the virus segments code for structural proteins of which dsRNA3 possibly codes for the capsid protein. Relative quantitative PCR studies of the 5 dsRNAs isolated from purified VLPs suggested that the segments are encapsidated separately in unequal amounts. Genomic structure of the virus and the phylogenic study of its RdRP and capsid proteins support that FgV-ch9 would possibly candidate as a type species for a novel genus in the family Chrysoviridae. Single conidia originating cultures of F. graminearum china 9 isolate were classified into three categories based on their association with various amounts of FgV-ch9 dsRNAs. Moderate and high virus titers of FgV-ch9 are associated with hypovirulence-related traits of china 9 isolate. These include disorganized cytoplasm with large vacuoles and membrane-bound structures, abnormal colony morphology with restricted growth rate, low conidiation capacity, inability to form perithecia, and reduced virulence on wheat and maize plants. To check if these phenotypes are due to the direct association with FgV-ch9, purified Virus-like Particles (VLPs) were transformed into the wild type fungal isolate PH1-GB. The results showed that FgV-ch9 transfected cultures of PH1-GB exhibit reduced pathogenicity of 10% - 50% for wheat and 20-30% for maize, a significant reduction in their conidiation capacity (>90%), and 5 folds reduction in perithecia formation. Simultaneous application of the china 9 and PH1-GB isolate on maize plants resulted in 3 folds reduction of the diseased kernels. When the genes encoded by FgV-ch9 dsRNA2, 3, 4, or 5 were constitutively expressed in cells of PH1-GB isolate, a reduction of 50-90% on the conidiation capacity of these cells was observed. Moreover, the results indicated that the genes encoded by dsRNA 2, 3, and 4 significantly reduced the pathogenicity of PH1-GB for wheat (42, 40, 54%, respectively) as well as for maize (46, 44, 38%, respectively). The over-expression of the gene encoded by dsRNA5 resulted in a less profound effect in either plant. These results confer that FgV-ch9 is associated with hypovirulence of F. graminearum and might constitute a prospective material for the control of FHB and ear rot diseases.